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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR条件摸索
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

[求助] PCR条件摸索

各位大侠。。。帮我看一下吧，从左到右分别是56度，58度，60度，61、62、63度，然后使阴性，MARKER。。。我的目的基因长度是1436bp。模板我用GADPH验证过的，所以这次Ｐ的时候就没有Ｐ内参。我想说的是既然我的阴性对照没有东西，说明我的引物没有引物二聚体，现在我想是不是应该改变一下PCR条件呢？帮忙分析一下吧。。。3Q so much。。。我想知道原因是什么呢？
我的PCR条件是94度 5min，94度40s，55-65度30s，72度3min，72度10min 总共35个循环。。。

zlf(9-13).jpg
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keepon
1楼 2012-09-13 15:31:47
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 18:40:54
引物特异性差，而且根据梯度PCR看，高温引物特异性没有增加，反而影响了引物与模板的结合，造成产物减少，最好还是重新设计下引物，另外1.5KB 延伸3分钟太长了吧

写错了 延伸2min。我这个引物有两篇文献是报道过的 用的就是这个引物来P的 所以我想应该没什么问题噻。。。
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keepon
5楼2012-09-13 22:18:19
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你的图看，貌似是你的退火温度有点高了，问什么不调低一点试一下呢？
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-13 16:39:56
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
阁下为什么说温度有点高了呢？我觉得特异性不好的话应该是温度低了呢。。。我还想把温度调高试一下呢。。嘿嘿。。。不懂。。。还请赐教。。。
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keepon
3楼2012-09-13 18:03:13
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物特异性差，而且根据梯度PCR看，高温引物特异性没有增加，反而影响了引物与模板的结合，造成产物减少，最好还是重新设计下引物，另外1.5KB 延伸3分钟太长了吧
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4楼2012-09-13 18:40:54
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