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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

[求助] PCR条件摸索

各位大侠。。。帮我看一下吧,从左到右分别是56度,58度,60度,61、62、63度,然后使阴性,MARKER。。。我的目的基因长度是1436bp。模板我用GADPH验证过的,所以这次P的时候就没有P内参。我想说的是既然我的阴性对照没有东西,说明我的引物没有引物二聚体,现在我想是不是应该改变一下PCR条件呢?帮忙分析一下吧。。。3Q so much。。。我想知道原因是什么呢?
我的PCR条件是94度 5min,94度40s,55-65度30s,72度3min,72度10min 总共35个循环。。。

zlf(9-13).jpg
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keepon
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-09-13 22:18:19
写错了 延伸2min。我这个引物有两篇文献是报道过的 用的就是这个引物来P的 所以我想应该没什么问题噻。。。...

如果说引物没有问题的话,会不会你的模板出现问题了,不知道你的模板怎么来的,会不会纯度不够,参杂着其他东西,另外你的PCR产物和Marker是点的同样的量吗,35个cycle你的PCR产物量太低了,一是有非特异性扩增,而是你的模板量少
6楼2012-09-13 23:09:29
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从你的图看,貌似是你的退火温度有点高了,问什么不调低一点试一下呢?
持之以恒、永不放弃!
2楼2012-09-13 16:39:56
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

阁下为什么说温度有点高了呢?我觉得特异性不好的话应该是温度低了呢。。。我还想把温度调高试一下呢。。嘿嘿。。。不懂。。。还请赐教。。。
keepon
3楼2012-09-13 18:03:13
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引物特异性差,而且根据梯度PCR看,高温引物特异性没有增加,反而影响了引物与模板的结合,造成产物减少,最好还是重新设计下引物,另外1.5KB 延伸3分钟太长了吧
4楼2012-09-13 18:40:54
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