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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 跪求各位高人：这个Western 到底出什么问题了啊
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求各位高人：这个Western 到底出什么问题了啊

各位虫高人：
    小虫我最近在做WESTERN ,做的是tPA,做了有一个月了，但是结果是各种奇怪，我也是通过各种方法去验证，去改正，但是又出了这样的结果，我直接崩溃。首先我的大概流程是这样的。
    1，TPA的分子量为63KD，我选用10%的分离胶，5%的浓缩胶，浓缩胶恒压70V, 分离胶是100V.
       2，湿转，恒压，110V,1H 40mins。转膜后的胶和NC膜我分别用考马斯亮蓝和丽春红去染色，确认转膜效率很高。
    3，用5%的脱脂牛奶封闭1H.
       4，一抗稀释比例从1:1000到1:50，前面一直不出来，没有任何条带，直到1:100和1:50，但结果很奇怪，所有蛋白全会曝出来，（结果会在后面附图，稀释液用了封闭液，也用了TBST尝试）。一抗是4度过夜孵育。
    5，二抗稀释比例是1:3000，孵育一小时，同样是用过封闭液或TBST 稀释。
    6，用ECL发光液，稀释10倍。
    7，曝光从最初的3s到后面的2h。
    现在不知道是哪里出问题了，可是前面是一直做不出来，曝光的片子上没有任何条带，但是昨天做的一抗稀释比例 1:100和1:50的结果更是诧异，现在我是没法了，请求高人指点一二，小虫我先谢过了。
    附注图片：这是一抗1:100的结果
    我的目的蛋白条带应该在上面，最亮的条带不是我的目的蛋白，这是怎么回事啊？怎么可以检测到其它蛋白呢，还比目的蛋白的条带亮？

1.jpg
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1楼 2012-09-07 17:25:31
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白不表达？
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2楼2012-09-08 13:15:59
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
通过其他方法检测目的蛋白没？检测抗体质量没？你怀疑过抗体有问题吗
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3楼2012-09-09 21:35:38
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-10 13:54:49
1.感觉上样量有点低；
2.怀疑一抗的特异性；建议换一抗
3.结果曝光无杂点、杂带，说明封闭之前的步骤无误；
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生活是一面镜子，要笑着面对！
4楼2012-09-10 00:44:43
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2012-09-08 13:15:59
你的蛋白不表达？

表达的，可出来就是这样
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5楼2012-09-10 12:07:13
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 494750284 at 2012-09-09 21:35:38
通过其他方法检测目的蛋白没？检测抗体质量没？你怀疑过抗体有问题吗

最近在做PCR，不过我确实怀疑了抗体
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6楼2012-09-10 12:08:19
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-10 00:44:43
1.感觉上样量有点低；
2.怀疑一抗的特异性；建议换一抗
3.结果曝光无杂点、杂带，说明封闭之前的步骤无误；

我目前没定量，但是我上样量都达到50微升了，可还是这样
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7楼2012-09-10 12:09:57
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小小技术官

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-09-10 12:08:19
最近在做PCR，不过我确实怀疑了抗体...

我记得师兄说过，蛋白上样量大的话，中间的lane就会分不清，不过感觉你的上样量还可以，问题应该主要在一抗特异性的问题上
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生活是一面镜子，要笑着面对！
8楼2012-09-10 12:50:03
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的几乎是和你出现过同样的问题，你的一抗是什么牌子的？换吧，是一抗的问题
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9楼2012-09-10 13:36:08
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jl860822 at 2012-09-10 13:36:08
我的几乎是和你出现过同样的问题，你的一抗是什么牌子的？换吧，是一抗的问题

我的一抗是SANTA 的，确实是出不来，我直接都快爆炸了，那你最后是换抗体了？
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10楼2012-09-11 22:39:58
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