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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] western Blotting 的问题已有2人参与

最近在做western,但是片子压的并不理想,现在上样量基本上是没问题,但是有些蛋白的背景很高,而且在发光的时候信号很不稳定,不知道是啥原因,师兄说可能是发光液的问题,再就是暗室的温度太高了,不利于发光反应的进行,我想问问大家发光的时候温度一般要求多少?再就是曝光时间的控制,怎么根据信号的强弱来控制曝光时间的长短,什么标准?还有一抗一般用的是多少倍的?1/1000?

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-11 at 16:37 ]
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+4,VIP+0):鼓励一下! 8-8 07:38
具体的温度没有试过,也没有考虑过
但曝光时间是可以调节的,我们一般用两张片子,第一张是呀一分钟,洗完后根据第一张的情况压第二张
抗体是要看效价的,不同的抗体效价不同,用的也不同,如果是买到的抗体有推荐小家,单抗都高,多抗一般较低,自制的抗体则要自己测效价的
2楼2009-08-08 00:38:21
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader


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在论坛搜索一下,好多帖子说明和分析原因的,你说的背景高很常见,原因很多;还有你的发光时那一种?有好多种显色的试剂,曝光时间掌握就不一样;一抗浓度稀释也不一定,看你的要求和经验,但是一般的gfp之类的现售的都有说明稀释多少倍
会当凌绝顶,一览众山小
3楼2009-08-09 21:25:22
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

发光液用的是TIANGEN 的,感觉很好用,加上去信号就显示出来了,现在比较头疼的是背景太高了,请问是什么原因呢?我的习惯是封闭完后的5%的奶粉直接在培养皿中稀释成1%加一抗,一般不再新配奶粉。这样对背景有影响吗?
4楼2009-08-11 22:53:52
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van_der

新虫 (初入文坛)


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洗的时间延长吧
5楼2010-05-19 22:00:04
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liyingye001

新虫 (初入文坛)


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请问,封闭之后,不用TBST洗PDVF膜会影响孵育一抗的效果么?
6楼2011-03-20 17:56:26
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