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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western Blotting 的问题
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] western Blotting 的问题 已有2人参与

最近在做western，但是片子压的并不理想，现在上样量基本上是没问题，但是有些蛋白的背景很高，而且在发光的时候信号很不稳定，不知道是啥原因，师兄说可能是发光液的问题，再就是暗室的温度太高了，不利于发光反应的进行，我想问问大家发光的时候温度一般要求多少？再就是曝光时间的控制，怎么根据信号的强弱来控制曝光时间的长短，什么标准？还有一抗一般用的是多少倍的？1/1000？

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-11 at 16:37 ]
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1楼 2009-08-07 23:23:57
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+4,VIP+0):鼓励一下！ 8-8 07:38
具体的温度没有试过，也没有考虑过
但曝光时间是可以调节的，我们一般用两张片子，第一张是呀一分钟，洗完后根据第一张的情况压第二张
抗体是要看效价的，不同的抗体效价不同，用的也不同，如果是买到的抗体有推荐小家，单抗都高，多抗一般较低，自制的抗体则要自己测效价的
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2楼2009-08-08 00:38:21
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
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在论坛搜索一下，好多帖子说明和分析原因的，你说的背景高很常见，原因很多；还有你的发光时那一种？有好多种显色的试剂，曝光时间掌握就不一样；一抗浓度稀释也不一定，看你的要求和经验，但是一般的gfp之类的现售的都有说明稀释多少倍
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会当凌绝顶，一览众山小
3楼2009-08-09 21:25:22
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
发光液用的是TIANGEN 的，感觉很好用，加上去信号就显示出来了，现在比较头疼的是背景太高了，请问是什么原因呢？我的习惯是封闭完后的5%的奶粉直接在培养皿中稀释成1%加一抗，一般不再新配奶粉。这样对背景有影响吗？
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4楼2009-08-11 22:53:52
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van_der

新虫 (初入文坛)
★
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洗的时间延长吧
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5楼2010-05-19 22:00:04
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liyingye001

新虫 (初入文坛)
★
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请问，封闭之后，不用TBST洗PDVF膜会影响孵育一抗的效果么？
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6楼2011-03-20 17:56:26
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