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long2502

金虫 (小有名气)


[交流] 问题请教-western blotting

最近小弟在做WB,使用的是HRP-ECL发光法:将A、B发光液按等比例稀释混合均匀滴在PVDF膜上,然后暴光显影(时间大于五分钟),能把目的条带显出来,但是我的内参显示不出,最后用DAB显影,可以看到明显的内参的带。
请问师兄师姐,师弟师妹,大哥大姐,小弟小妹们,why? how to tackle the problem.
Thank you.

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-7 at 11:31 ]
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KinnerHuang

新虫 (初入文坛)



long2502(金币+1):谢谢参与
首先恭喜你做出来啦!理论上内参也显示不出来 你加的一抗、二抗跟目的蛋白结合的 不跟内参结合的; HRP在二抗上 不跟内参结合 内参怎么会显影呢?
2楼2011-08-04 10:27:05
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long2502

金虫 (小有名气)


我的意思,能把目的条带做出来。然后再加B-actin一抗,过夜,然后加B-actin二抗,然后去显影,但就是显不出来了。就算我延长暴光时间还是白版了。目的条
带能显出来,说明提的蛋白或者跑胶,转膜都没有多大问题了。
3楼2011-08-04 19:31:21
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晴天1882

木虫 (正式写手)



long2502(金币+1):谢谢参与
也不知道你在哪里提取的蛋白,会不会是此种内参蛋白不表达?根本没有内参蛋白,所以加完抗体也没有,重新选个内参看看
4楼2011-08-05 18:16:49
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lzpbar

至尊木虫 (著名写手)



long2502(金币+1):谢谢参与
没做过。友情帮顶。。
5楼2011-08-05 18:52:59
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明若瞳兮

新虫 (初入文坛)



long2502(金币+1):谢谢参与
很可能是抗体不好了~~新配个抗体试试吧
7楼2011-08-06 21:11:34
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zhu-hongwen

至尊木虫 (知名作家)



long2502(金币+1):谢谢参与
学习。友情帮顶。
10楼2011-08-07 00:45:30
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luckey2880

木虫 (知名作家)



long2502(金币+1):谢谢参与
学习帮顶
11楼2011-08-07 07:15:15
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青米

银虫 (正式写手)



long2502(金币+1): 谢谢参与
学习。友情帮顶。
14楼2013-04-06 21:28:07
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gcworm

木虫 (职业作家)


路过,帮顶一下
15楼2013-04-06 22:36:25
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简单回复
2011-08-05 19:20   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
2011-08-06 21:14   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by 明若瞳兮 at 2011-08-06 21:11:34: 很可能是抗体不好了~~新配个抗体试试吧

xuanzhang9楼
2011-08-06 21:35   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
2011-08-07 07:29   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
顶一下
fuyouzhi13楼
2011-08-07 07:49   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
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