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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 问题请教-western blotting
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long2502

金虫 (小有名气)

[交流] 问题请教-western blotting

最近小弟在做WB，使用的是HRP-ECL发光法：将A、B发光液按等比例稀释混合均匀滴在PVDF膜上，然后暴光显影（时间大于五分钟），能把目的条带显出来，但是我的内参显示不出，最后用DAB显影，可以看到明显的内参的带。
请问师兄师姐，师弟师妹，大哥大姐，小弟小妹们，why? how to tackle the problem.
Thank you.

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-7 at 11:31 ]
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1楼 2011-08-03 08:28:12
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long2502

金虫 (小有名气)
我的意思，能把目的条带做出来。然后再加B-actin一抗，过夜，然后加B-actin二抗，然后去显影，但就是显不出来了。就算我延长暴光时间还是白版了。目的条
带能显出来，说明提的蛋白或者跑胶，转膜都没有多大问题了。
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3楼2011-08-04 19:31:21
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KinnerHuang

新虫 (初入文坛)
★
long2502(金币+1):谢谢参与
首先恭喜你做出来啦！理论上内参也显示不出来 你加的一抗、二抗跟目的蛋白结合的 不跟内参结合的； HRP在二抗上 不跟内参结合 内参怎么会显影呢？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-08-04 10:27:05
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晴天1882

木虫 (正式写手)
★
long2502(金币+1):谢谢参与
也不知道你在哪里提取的蛋白，会不会是此种内参蛋白不表达？根本没有内参蛋白，所以加完抗体也没有，重新选个内参看看
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4楼2011-08-05 18:16:49
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lzpbar

至尊木虫 (著名写手)
★
long2502(金币+1):谢谢参与
没做过。友情帮顶。。
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5楼2011-08-05 18:52:59
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blackrose80898楼
2011-08-06 21:14   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by 明若瞳兮 at 2011-08-06 21:11:34: 很可能是抗体不好了~~新配个抗体试试吧

sa100200316楼
2011-08-05 19:20   回复  
long2502(金币+1):谢谢参与
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