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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做western实验中问题请教
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andia

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】做western实验中问题请教

各位好
本人在做western blot实验时，样品准备好后，通过BCA法测定了蛋白浓度，上样时能过调整上样量使各样品间蛋白浓度保持一致
样品煮沸后有的样品有很大块的沉淀
最后点样时发现，有两个样品的颜色明显浅于其它的，最后结果也是显示这两个样品蛋白量明显少
明明是蛋白量一样的，不知道为什么会出现这种情况
有做过western blot实验的同学请帮忙出出主意，分析分析
谢谢大家了！
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1楼 2010-09-09 21:34:36
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
andia(金币+1): 2010-09-10 16:36:40
andia(金币+2):我是根据蛋白浓度调整成一样的了，能否具体说说你说的离子浓度是怎么回事？ 2010-09-10 16:38:16
与样品的离子浓度有关系，你可以将上样的浓度调整一样，然后体积少的用上样buffer补齐就行。
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52187644
2楼2010-09-09 22:09:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
andia(金币+3):离心过的了，buffer配的时间也不长 2010-09-10 16:37:31
通过蛋白裂解液收集蛋白之后有没有通过离心来去除杂质呢？
其次就是loading buffer有没有过期……
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3楼2010-09-09 22:53:38
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285459331

铁虫 (小有名气)
坐待高手回答。
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生命不止，奋斗不息
4楼2010-09-09 22:58:56
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evan1987

铜虫 (小有名气)
andia(金币+3):为什么这么说，能否具体说明下？ 2010-09-10 16:38:53
你蛋白变性不充分啊。
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5楼2010-09-09 23:03:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
lstt09nk:离心后还要吹打的话，那些沉淀会不会又混合到溶液中呢？离心的目的就是要离掉沉淀啊~ 2010-09-11 19:49:00
那些 沉淀能否通过吹打而复溶？因为没有看到实物所以比较难判断
一般煮沸后离心，还得再吹打一次再上样，不然会不准
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6楼2010-09-11 09:39:18
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sdqzsdqz

木虫 (著名写手)
你的问题在于收集蛋白时候离心时间或者转速不够，还有就是煮了上样品前也要高速离心的，只取上清的。这样还定量有问题的话，那就是你的定量操作有问题了。
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7楼2010-09-11 10:33:51
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by andia at 2010-09-09 21:34:36:
各位好
本人在做western blot实验时，样品准备好后，通过BCA法测定了蛋白浓度，上样时能过调整上样量使各样品间蛋白浓度保持一致
样品煮沸后有的样品有很大块的沉淀
最后点样时发现，有两个样品的颜色 ...

你的“蛋白量一样的”是如何调整的呢？或许和调整方法有关呢
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见得多爱的多
8楼2011-01-10 09:04:48
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
上样缓冲液的问题
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
9楼2011-01-10 09:10:09
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