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跪求各位高人：这个Western 到底出什么问题了啊
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各位虫高人： 小虫我最近在做WESTERN ,做的是tPA,做了有一个月了，但是结果是各种奇怪，我也是通过各种方法去验证，去改正，但是又出了这样的结果，我直接崩溃。首先我的大概流程是这样的。 1，TPA的分子量为63KD，我选用10%的分离胶，5%的浓缩胶，浓缩胶恒压70V, 分离胶是100V. 2，湿转，恒压，110V,1H 40mins。转膜后的胶和NC膜我分别用考马斯亮蓝和丽春红去染色，确认转膜效率很高。 3，用5%的脱脂牛奶封闭1H. 4，一抗稀释比例从1:1000到1:50，前面一直不出来，没有任何条带，直到1:100和1:50，但结果很奇怪，所有蛋白全会曝出来，（结果会在后面附图，稀释液用了封闭液，也用了TBST尝试）。一抗是4度过夜孵育。 5，二抗稀释比例是1:3000，孵育一小时，同样是用过封闭液或TBST 稀释。 6，用ECL发光液，稀释10倍。 7，曝光从最初的3s到后面的2h。 现在不知道是哪里出问题了，可是前面是一直做不出来，曝光的片子上没有任何条带，但是昨天做的一抗稀释比例 1:100和1:50的结果更是诧异，现在我是没法了，请求高人指点一二，小虫我先谢过了。 附注图片：这是一抗1:100的结果 我的目的蛋白条带应该在上面，最亮的条带不是我的目的蛋白，这是怎么回事啊？怎么可以检测到其它蛋白呢，还比目的蛋白的条带亮？  1.jpg |
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