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漫天流萤

新虫 (小有名气)

[求助] 关于大肠杆菌转化

本人使用的是电转，转进去的质粒带有卡那霉素抗性，转完以后用含100mg/L的卡纳LB板涂匀，长出菌落后，挑单菌落做菌落PCR，为神马显示不出阳性？
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1楼 2012-08-28 21:19:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-29 16:27:53
我明白楼主的意思，因为电转化考虑到连接体系离子浓度的问题，一般都是先连接好了验证成功提质粒再电转化，我建议考虑一下抗生素的问题，有时候电转之后细菌耐受抗生素的浓度会升高，具体什么原因我不太清楚，但是我遇到过这种情况。还有一个可能是菌落pcr体系的问题，有时候pcr验证可能不准确，既然是大肠杆菌的话，提质粒酶切一下看看也行啊
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8楼2012-08-29 11:43:11
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skmlz87

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
9楼2012-08-29 16:42:22
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普通回帖

137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那就是说你转的都是空载体啊，没有连接上啊
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总有一天我要修改用户名。
2楼2012-08-28 22:04:12
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漫天流萤

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 137167741 at 2012-08-28 22:04:12
那就是说你转的都是空载体啊，没有连接上啊

但是载体在转化之前PCR验证过的呀。
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3楼2012-08-28 22:05:02
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anyanqiu

银虫 (初入文坛)
不是很明白你的问题，如果你是在载体上连接了目的片段的话，出现这种问题，可能是你挑的菌落是空载体，就是没有连接上目的片段，可以多挑写菌落进行验证。因为你的空载体和转入目的片段的载体均有卡纳抗性，所以在卡纳平板上长出的菌落空载体的会占据绝大部分
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4楼2012-08-28 22:27:02
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 漫天流萤 at 2012-08-28 22:05:02
但是载体在转化之前PCR验证过的呀。...

怎么验证的啊？pcr吗？没有连接上，不是照样可以检测出来吗？反正都在一个管子里。
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总有一天我要修改用户名。
5楼2012-08-29 08:49:12
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漫天流萤

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anyanqiu at 2012-08-28 22:27:02
不是很明白你的问题，如果你是在载体上连接了目的片段的话，出现这种问题，可能是你挑的菌落是空载体，就是没有连接上目的片段，可以多挑写菌落进行验证。因为你的空载体和转入目的片段的载体均有卡纳抗性，所以在卡 ...

不是，我的载体是从菌落PCR阳性的菌里提出来，然后又进行了质粒PCR，验证出来有了以后，才做的转化。
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6楼2012-08-29 10:45:29
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漫天流萤

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 137167741 at 2012-08-29 08:49:12
怎么验证的啊？pcr吗？没有连接上，不是照样可以检测出来吗？反正都在一个管子里。...

没有连接那步，因为那个质粒是从验证过的菌弄出来的。按理不用再验证，我只是在练手，但是还是转不出来，所以不太理解。
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7楼2012-08-29 10:46:44
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电转化和菌落pcr体系可能会出现问题，建议提个质粒酶切鉴定下，如果没有的话，那就是电转化的问题了，祝实验顺利。。。。。。
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10楼2012-08-30 10:07:04
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