[交流] PRC出现大量非特异性条带已有8人参与

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1楼2012-08-28 14:53:26

回帖置顶 ( 共有1个 )

三十不惑

铜虫 (小有名气)

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amisking: 回帖置顶 2012-08-28 19:39:54
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-28 19:40:02

我也碰到过，排除了很多问题，最终也没找到确切的原因，最后还是无奈换了引物，就没问题了。由此分析应该还是引物本身的问题，或者多个结合位点，或者非特异结合，也可能是引物自身出现多聚。我也对PCR结果进行了测序，就使用了PCR引物，但是测序公司说不能结合测不出来。我对这个问题也非常好奇，如果你能找到原因，一定要告诉我呵呵。
目前看来要想解决问题，最有效的还是直接更换引物。

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3楼2012-08-28 15:36:28

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yaolinlshang

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我的实验也是这样。

最是人间留不住，朱颜辞镜花辞树！

2楼2012-08-28 15:21:57

616057157

铜虫 (小有名气)

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看看Tap酶的量，主要是引物和退火温度的问题

不曾拥有何谈失去，不必伤心！！！

4楼2012-08-28 16:02:03

lidonghong

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做一个touchdown PCR就可以了

生物化学与分子生物学

5楼2012-08-28 16:39:54

lidonghong

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或者将你要的产物切胶回收后在以此产物为模板进行PCR就可以了

生物化学与分子生物学

6楼2012-08-28 16:40:30

wzqno

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只能说明你的引物特异性太差，或者内部有识别序列，建议重新搞引物，像touchdown，taq酶什么没关系

7楼2012-08-29 00:05:41

joan198108

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出现非特异性条带主要还是引物设计问题。但是在不改变引物的前提下，还是可能试着通过减少循环数同时增加模板量以及提高退火温度等方式解决问题。

8楼2012-08-29 09:06:41

sd3824289

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如果排除了各种可能（退火温度、酶量等）外还不能有效的解决这个问题，就换引物！

坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！

9楼2012-08-31 09:56:16

Marado

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楼主给的条件太少，起码把你的电泳图贴一下，PCR条件，引物等等.另外非特异性条带出现的原因有很多，下面给你列举一下，你可以逐一排除.
原因：
1.引物特异性差
2.模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1.重新设计引物或者使用巢式PCR
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
PS：祝楼主实验顺利.

Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

10楼2012-08-31 11:31:34