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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 过氧化氢酶CAT的测定问题
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a71840584

金虫 (正式写手)

[求助] 过氧化氢酶CAT的测定问题

找到两种方案看上去好像差不多但是感觉有差很大，请高手给看看哪种对：
第一种：
参照徐镜波(1997)等方法。在室温条件下，用 UV762 紫外光度计测定。参比池为 0.01mL 酶样＋3.0mL 磷酸盐缓冲液Ⅰ；样品池为 0.01mL酶样＋3.0mL H2O2-磷酸盐缓冲液Ⅱ。采用波长 250nm，1cm 石英比色皿，在 0~60s 内每隔 5s 测定 H2O2吸光度，计算酶活性。定义 25℃下，100s 内使过氧化氢分解 1/2 时的酶蛋白量为 1 个 CAT 活性单位。
第二种：
反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。

第一种好像是测鱼的，但是我们实验室一已经毕业的师姐用这个测蚕豆的还发表文章了，我想问问测植物的是按第一种方法还是第二种方法好？是必须在240nm下测还是250nm也行？
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再牛逼的肖邦也弹不出哥的忧伤。。。
1楼2012-08-14 15:41:09
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 亚先 at 2013-05-16 10:23:47
恩恩 谢谢 请问您是用的什么方法测蛋白含量？我用的核酸蛋白成像仪2微升酶液加98微升水，不知是否可行？...

最简单的考马斯亮蓝法就可以，核算蛋白成像仪我没用过，是基于紫外吸收法测定么？如果是紫外吸收法就不太适用。这个方法是基于一些特定氨基酸残基共轭双键测定，对于不同蛋白测定结果差别很大，必须用你的待测蛋白做标准曲线，另外，样品中的嘌呤嘧啶等也会影响结果。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
8楼2013-05-16 16:04:34
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litingwen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
SongQ5285: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-14 17:29:41
我们实验室测定水稻采用的是第一种方法
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2楼2012-08-14 16:12:07
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
SongQ5285: 金币+2, 经验 2012-08-14 17:29:02
a71840584: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-25 10:17:59
这两种方法我感觉没什么差别，我自己用的是类似第二种的方法，这个做法也是有可信的文献出处的。面对这些方法差异，如果愿意深究，可以发掘一下最早对方法的报道以及一些改进文章，分析机理，了解改进原理，来作出判断。如果图省事，直接查查植物学几个大杂志（如plant cell，plant J，plant phy， New phyto）上，已发表的文章检测相关指标用什么方法，直接copy就行，这样就算以后发SCI也不会有审稿人提出异议。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
3楼2012-08-14 17:21:49
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atom150

金虫 (小有名气)
★ ★
SongQ5285: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-16 21:16:09
两种方法本质上没差别，测这个酶就是检测过氧化氢的量的变化，以确定这个反应速率来表征酶的活性，只要你的所有样品都保证在同一条件下测就行，些许改进不会影响你的实验结论。
波长应是过氧化氢的最大吸收波长

其实酶活很难侧准确的，影响因素太多，不好控制。
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4楼2012-08-16 20:54:14
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