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a71840584

金虫 (正式写手)

[求助] 过氧化氢酶CAT的测定问题

找到两种方案看上去好像差不多但是感觉有差很大,请高手给看看哪种对:
第一种:
参照徐镜波(1997)等方法。在室温条件下,用 UV762 紫外光度计测定。参比池为 0.01mL 酶样+3.0mL 磷酸盐缓冲液Ⅰ;样品池为 0.01mL酶样+3.0mL H2O2-磷酸盐缓冲液Ⅱ。采用波长 250nm,1cm 石英比色皿,在 0~60s 内每隔 5s 测定 H2O2吸光度,计算酶活性。定义 25℃下,100s 内使过氧化氢分解 1/2 时的酶蛋白量为 1 个 CAT 活性单位。
第二种:
反应液配制:取200ml PBS(0.15M,pH7.0),加入0.3092ml 30%的H2O2(原液)摇匀即可。
(3)样品测定:取3ml反应液加入0.1ml(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定OD240(紫外)(测定40s)。

第一种好像是测鱼的,但是我们实验室一已经毕业的师姐用这个测蚕豆的还发表文章了,我想问问测植物的是按第一种方法还是第二种方法好?是必须在240nm下测还是250nm也行?
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再牛逼的肖邦也弹不出哥的忧伤。。。
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亚先

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by starseacow at 2013-05-15 22:47:12
最好用U/mg来表示,你很难保证每次提取样品中蛋白含量一定...

恩恩 谢谢 请问您是用的什么方法测蛋白含量?我用的核酸蛋白成像仪2微升酶液加98微升水,不知是否可行?
说到做到这就是我的忍道
7楼2013-05-16 10:23:47
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查看全部 13 个回答

litingwen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
SongQ5285: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-14 17:29:41
我们实验室测定水稻采用的是第一种方法
2楼2012-08-14 16:12:07
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
SongQ5285: 金币+2, 经验 2012-08-14 17:29:02
a71840584: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-25 10:17:59
这两种方法我感觉没什么差别,我自己用的是类似第二种的方法,这个做法也是有可信的文献出处的。面对这些方法差异,如果愿意深究,可以发掘一下最早对方法的报道以及一些改进文章,分析机理,了解改进原理,来作出判断。如果图省事,直接查查植物学几个大杂志(如plant cell,plant J,plant phy, New phyto)上,已发表的文章检测相关指标用什么方法,直接copy就行,这样就算以后发SCI也不会有审稿人提出异议。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
3楼2012-08-14 17:21:49
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atom150

金虫 (小有名气)

★ ★
SongQ5285: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-16 21:16:09
两种方法本质上没差别,测这个酶就是检测过氧化氢的量的变化,以确定这个反应速率来表征酶的活性,只要你的所有样品都保证在同一条件下测就行,些许改进不会影响你的实验结论。
波长应是过氧化氢的最大吸收波长

其实酶活很难侧准确的,影响因素太多,不好控制。
4楼2012-08-16 20:54:14
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