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imzhanghao

木虫 (小有名气)

[求助] 求助:PCR产物电泳图片怎么会这样?

求助:PCR 400bp 左右的片段,用的是takara的ExTaq酶,结果跑电泳如图,是什么原因?另旁边的marker是2000bp的。 好像二聚体特别多。

PCR电泳图片
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

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不是引物二聚体特别多,是没有目的条带,是不是模版浓度太大了?
jiayoubashaonian
4楼2012-08-12 14:21:30
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chicharito

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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引物问题。 退火温度没设计好,或引物设计有问题。 建议跑梯度,如果还是这种情况,重新合引物
姿态----
5楼2012-08-12 16:59:06
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普通回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-08-13 15:00:55
那不是引物二聚体,是非特异性扩增。好像是引物没有结合到模板上去。把退火温度和模板都降低,采用touchdown程序可能会好一些。
2楼2012-08-12 01:48:23
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王贤卓

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-13 15:01:09
非特异扩增有如下原因:
引物特异性差
引物浓度过高
酶量过多
Mg2+浓度偏高
退火温度偏低
循环次数过多
3楼2012-08-12 09:01:31
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-08-13 15:01:24
楼主可用如下几个途径试试是否有帮助,如果如下几个方面都不能解决,我觉得最好就换引物。
1,降低模板用量。
2,降低引物用量。
3,降低镁离子浓度。,
4,降低循环数。
5,提高退火温度。
6楼2012-08-13 08:14:43
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charlen520

银虫 (初入文坛)

我也觉得可能是模版浓度太大了。
7楼2012-08-13 09:43:22
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imzhanghao

木虫 (小有名气)

imzhanghao: 回帖置顶 2012-08-13 15:08:38
首先谢谢各位的分析,我的模板浓度非常低测了只有不到2ng/ul.
而只加了2微升的模板,所以排除模板浓度高的原因。退火温度提高了5度,引物浓度降低到原来的一半,循环次数降低了还是出现了和原图一样的情况。现在只剩下可能是引物的问题了
8楼2012-08-13 15:08:30
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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为什么胶孔上面也有条带?
9楼2012-08-14 15:49:41
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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我觉得:
1 模板质量不好,可能造成条带弥散
2 退货温度过高或过低,建议touchdown
3 引物的设计有问题,重新设计引物
10楼2012-08-14 17:39:18
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