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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么PCR扩增出来使这个样子，各位高手帮忙支招吧！
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wangning__

木虫 (正式写手)

[求助] 为什么PCR扩增出来使这个样子，各位高手帮忙支招吧！

古菌槽式扩增，以全长的50，100，150，200稀释为模版，得到下面的图，为什么有杂带，后来提高退火温度2℃，4℃，延伸时间缩短15s，20s，还是这个样子，换了新的体系试剂还是没有消除，这是什么原因呢？
PS：引物为109/1510;109/515，扩增产物用于DGGE

求求各位大侠给支个招吧，小妹实在是找不出原因了。

2000的marker,分别为全长扩增产物稀释50倍，100，150，200倍，其它条件一致
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乌拉拉
1楼 2012-08-04 10:38:25
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zhsDONG

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wangning__: 金币+1 2012-08-05 09:23:34
可能是引物的特异性不是很强
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2楼2012-08-04 14:33:48
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wangning__: 金币+3 2012-08-05 09:24:01
减少pcr循环数和模版量试一下。除了引物的可能行外，也有可能是模版质量不好，有降解。
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3楼2012-08-04 21:18:12
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eagles123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wangning__: 金币+1 2012-08-05 09:24:13
也可以试试 用PCR产物稀释100倍后作为模板再扩增看还有没有杂带
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4楼2012-08-04 22:00:14
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板量适当降低 再说如果目的条带对 你可以切胶回收 不必要纠结这个问题
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wangning__
5楼2012-08-05 09:08:48
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西区五号楼

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wangning__: 金币+3, ★有帮助 2012-08-06 09:45:47
可以切胶回收之后！也可以做个巢式PCR试试！做DGGE的话，这个亮度貌似已经很好了！
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6楼2012-08-05 09:24:01
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wangning__

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by snzydong at 2012-08-05 09:08:48
模板量适当降低 再说如果目的条带对 你可以切胶回收 不必要纠结这个问题

这个已经是稀释后的了，还是不可以。PCR产物不好的话会严重影响DGGE的，所以必须优化，但是我又不会切胶回收，跪求指点一下...
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乌拉拉
7楼2012-08-05 09:26:59
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dajiong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wangning__: 金币+2, ★有帮助 2012-08-06 09:46:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by wangning__ at 2012-08-05 09:26:59
这个已经是稀释后的了，还是不可以。PCR产物不好的话会严重影响DGGE的，所以必须优化，但是我又不会切胶回收，跪求指点一下......

切胶回收买个试剂盒就可以了呀         promega的tiangen的omega的都有    按说明书就可以了。
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哦也
8楼2012-08-05 21:18:51
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damaomao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-08-06 16:31:40
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-07 15:37:57
建议楼主做个温度梯度试试，我筛选条件的时候都是用这个方法，很好的！基本上做一次就知道最适退火温度了，一般情况下，如果两次PCR用到得酶不一样，也会导致在相同的退火温度下得到不一样的结果！模板浓度如果高，建议加0.5μl就够了，如果浓度不高，就得加1μL，引物浓度应该都是10MM！祝楼主好运！
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wangning__
坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
10楼2012-08-07 09:26:53
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