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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核载体构建
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wangmin2010

新虫 (小有名气)

[求助] 原核载体构建

求助：
    我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1
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自己的人生是要靠自己改变的！
1楼 2012-07-31 19:39:49
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
恩，在看呢，可是我还是找不到我的问题出在了什么地方？
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自己的人生是要靠自己改变的！
2楼2012-07-31 19:59:47
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
目的片段是1.4K,载体是3K，酶切回收后条带挺亮的，连接体系是10ul,各种比例都试过了，但板上什么都不长，
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自己的人生是要靠自己改变的！
3楼2012-07-31 20:44:45
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是感受态的问题，一般连不上就是这些问题。
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coasttocoast。
4楼2012-07-31 21:00:09
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-31 21:00:09
是不是感受态的问题，一般连不上就是这些问题。

感受态是自己做的，转化质粒的话，能长满板子，挑了几个做鉴定，也都能提出质粒，可是转连接产物就什么也不长
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自己的人生是要靠自己改变的！
5楼2012-07-31 21:31:57
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangmin2010 at 2012-07-31 21:31:57
感受态是自己做的，转化质粒的话，能长满板子，挑了几个做鉴定，也都能提出质粒，可是转连接产物就什么也不长...

我以前做的时候也遇到过这样地问题，看看连接的比例，一般载体和片段的比例为1:5到1:8，是摩尔质量比。
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coasttocoast。
6楼2012-07-31 22:34:34
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 还真是酶切专家哦，鼓励热心的虫虫 2012-08-01 13:44:18
克隆不成功最常见的原因是载体或PCR产物酶切不完全。
载体酶切时，最难得部分是如何判断载体是否完全酶切的方法，因为只有载体的完全双酶切，才能保证较高的克隆效率，减少假阳性。
一般来说，可以通过电泳分析来初步判断是否完全酶切：
1）如果你的载体上两个酶切位点间有一个较大的片段（大于300bp),那么一般通过电泳带型很容易判断出双酶切的效率，因为单切和双切后的载体大小是不一样的，而且还有酶切后产生的小片段提供参考。
2）如果你的载体上两个酶切位点很靠近，如大部分载体的多克隆位点序列。那么判断载体是否完全双酶切就比较麻烦。一般比较科学的方法是设置两种单酶切对照。即比照双酶切体系，分别进行实验所用的两种酶的单酶切，然后与双酶切样品同时进行电泳分析，注意，电泳时还需要设置未酶切的质粒对照。通过电泳的带型来判断在设定的酶切条件下（包括质量用量，buffer,酶的用量等），酶切是否完全。
3）而PCR产物的酶切效率通常很难判断，常用的电泳检测方法也不适用。但PCR产物的酶切还是有一些基本的原则，如：
A: 由于PCR产物的分子通产较载体分子小，因而在进行PCR产物酶切是，建议用较少的PCR产物（300-500ng)进行酶切，
B:而且通常PCR产物酶切时所用的酶量较载体酶切所需的酶量还要多（具体原因，可以参考各种限制性内切酶的单位定义）。

事实上，由于限制性内切酶单位定义的特殊性，不同的酶在实际使用时，所需的用量差别较大（如XbaI的用量就应该比KpnI多10倍左右）。建议你使用一些能够精确计算酶切时限制性内切酶用量的软件计算，确保载体和PCR酶切的完全和彻底。我在小木虫上推荐过一个软件（double digestion designer),你可以试一试
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7楼2012-08-01 00:01:57
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-31 22:34:34
我以前做的时候也遇到过这样地问题，看看连接的比例，一般载体和片段的比例为1:5到1:8，是摩尔质量比。...

我是胶回收后跑电泳，根据条带估计值，然后按1：3的比例连的，比如载体25ng/ul,目的片段是30ng/ul，我做的10ul连接体系：
载体：4ul
目的片段：4.5ul
连接酶：0.5ul
buffer:1ul
构建这个载体已经挺长时间了，各种比例差不多都试过，不知道这那样算摩尔质量比对吗？
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自己的人生是要靠自己改变的！
8楼2012-08-01 18:58:33
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-08-01 00:01:57
克隆不成功最常见的原因是载体或PCR产物酶切不完全。
载体酶切时，最难得部分是如何判断载体是否完全酶切的方法，因为只有载体的完全双酶切，才能保证较高的克隆效率，减少假阳性。
一般来说，可以通过电泳分析来 ...

谢谢，我试试吧，之前我试过分部酶切，先用KpnI切四个小时，然后回收，在用XbaI酶切三个小时回收，然后在做连接，可是还是失败。
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自己的人生是要靠自己改变的！
9楼2012-08-01 19:02:01
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励热心积极交流 2012-08-02 15:39:52
个人有些想法：
1.先确保载体被切开，分别用你的两种酶单酶切，双酶切，然后跑胶，没有问题再往下做。
2.再确认下酶的说明书，PCR产物有些要求，是要切久一点的，不过，你切4h,应该够了。回收后的效率如何，PCR产物有多大？胶回收试剂盒的分辨率可以达到吗？
3.确保连接酶没有问题，我就试过一次连接酶坏了，做几次都没有出来。连接体系中，载体与目的片段如何？
4.确认感受态木有问题.
希望对你有帮助！
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10楼2012-08-01 19:59:15
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