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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核载体构建
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wangmin2010

新虫 (小有名气)

[求助] 原核载体构建

求助：
    我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1
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自己的人生是要靠自己改变的！
1楼 2012-07-31 19:39:49
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-31 22:34:34
我以前做的时候也遇到过这样地问题，看看连接的比例，一般载体和片段的比例为1:5到1:8，是摩尔质量比。...

我是胶回收后跑电泳，根据条带估计值，然后按1：3的比例连的，比如载体25ng/ul,目的片段是30ng/ul，我做的10ul连接体系：
载体：4ul
目的片段：4.5ul
连接酶：0.5ul
buffer:1ul
构建这个载体已经挺长时间了，各种比例差不多都试过，不知道这那样算摩尔质量比对吗？
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自己的人生是要靠自己改变的！
8楼2012-08-01 18:58:33
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
恩，在看呢，可是我还是找不到我的问题出在了什么地方？
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自己的人生是要靠自己改变的！
2楼2012-07-31 19:59:47
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
目的片段是1.4K,载体是3K，酶切回收后条带挺亮的，连接体系是10ul,各种比例都试过了，但板上什么都不长，
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自己的人生是要靠自己改变的！
3楼2012-07-31 20:44:45
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是感受态的问题，一般连不上就是这些问题。
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coasttocoast。
4楼2012-07-31 21:00:09
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