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wangmin2010

新虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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[求助] 原核载体构建

求助：
我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1

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自己的人生是要靠自己改变的！

1楼 2012-07-31 19:39:49

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酶切专家

金虫 (小有名气)

MolEPI: 2
应助: 96 (初中生)
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注册: 2012-02-27
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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 还真是酶切专家哦，鼓励热心的虫虫 2012-08-01 13:44:18

克隆不成功最常见的原因是载体或PCR产物酶切不完全。
载体酶切时，最难得部分是如何判断载体是否完全酶切的方法，因为只有载体的完全双酶切，才能保证较高的克隆效率，减少假阳性。
一般来说，可以通过电泳分析来初步判断是否完全酶切：
1）如果你的载体上两个酶切位点间有一个较大的片段（大于300bp),那么一般通过电泳带型很容易判断出双酶切的效率，因为单切和双切后的载体大小是不一样的，而且还有酶切后产生的小片段提供参考。
2）如果你的载体上两个酶切位点很靠近，如大部分载体的多克隆位点序列。那么判断载体是否完全双酶切就比较麻烦。一般比较科学的方法是设置两种单酶切对照。即比照双酶切体系，分别进行实验所用的两种酶的单酶切，然后与双酶切样品同时进行电泳分析，注意，电泳时还需要设置未酶切的质粒对照。通过电泳的带型来判断在设定的酶切条件下（包括质量用量，buffer,酶的用量等），酶切是否完全。
3）而PCR产物的酶切效率通常很难判断，常用的电泳检测方法也不适用。但PCR产物的酶切还是有一些基本的原则，如：
A: 由于PCR产物的分子通产较载体分子小，因而在进行PCR产物酶切是，建议用较少的PCR产物（300-500ng)进行酶切，
B:而且通常PCR产物酶切时所用的酶量较载体酶切所需的酶量还要多（具体原因，可以参考各种限制性内切酶的单位定义）。

事实上，由于限制性内切酶单位定义的特殊性，不同的酶在实际使用时，所需的用量差别较大（如XbaI的用量就应该比KpnI多10倍左右）。建议你使用一些能够精确计算酶切时限制性内切酶用量的软件计算，确保载体和PCR酶切的完全和彻底。我在小木虫上推荐过一个软件（double digestion designer),你可以试一试