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wangmin2010

新虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by 84146922 at 2012-08-01 19:59:15
个人有些想法：
1.先确保载体被切开，分别用你的两种酶单酶切，双酶切，然后跑胶，没有问题再往下做。
2.再确认下酶的说明书，PCR产物有些要求，是要切久一点的，不过，你切4h,应该够了。回收后的效率如何，PCR产 ...

单酶切，双酶切，都试过了，都能发出来，回收后跑电泳条带也挺亮的，可就是连不上
连接酶也换新的，
感受态是自己做的，涂质粒没问题，能涨一板子
在连接体系中载体与目的片段的各处比例都试过了，都连不下30次了

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自己的人生是要靠自己改变的！

11楼2012-08-01 20:24:58

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wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

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【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:40:11

分析了这么多原因还做不出来。
有个疑问是酶切后的片段跑电泳亮不亮？
载体酶切很容易看出是否没酶切完全（分别作单酶切看看条带大小）
就是PCR片段酶切可能出问题。（不知道你片段上有没有加保护碱基，如果没有，肯定切不出来）
实在不行，可以将你PCR片段纯化后（普通taq酶），与T载体连接，转化到大肠杆菌中，扩增，抽质粒，然后再进行酶切，回收目的片段。（有时候有些酶的保护碱基要求比较严格，通过PCR方法加保护碱基不是很现实，可以通过该方法使酶切变得容易）
最后预祝实验成功。

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12楼2012-08-02 10:57:33

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