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wangmin2010

新虫 (小有名气)

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[求助] 原核载体构建

求助：
我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1

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自己的人生是要靠自己改变的！

1楼 2012-07-31 19:39:49

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wangmin2010

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引用回帖:

10楼: Originally posted by 84146922 at 2012-08-01 19:59:15
个人有些想法：
1.先确保载体被切开，分别用你的两种酶单酶切，双酶切，然后跑胶，没有问题再往下做。
2.再确认下酶的说明书，PCR产物有些要求，是要切久一点的，不过，你切4h,应该够了。回收后的效率如何，PCR产 ...

单酶切，双酶切，都试过了，都能发出来，回收后跑电泳条带也挺亮的，可就是连不上
连接酶也换新的，
感受态是自己做的，涂质粒没问题，能涨一板子
在连接体系中载体与目的片段的各处比例都试过了，都连不下30次了