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wangmin2010

新虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 271.1
帖子: 85
在线: 34.6小时
虫号: 1197771
注册: 2011-01-29
性别: MM

[求助] 原核载体构建

求助：
我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1

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自己的人生是要靠自己改变的！

1楼 2012-07-31 19:39:49

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

应助: 73 (初中生)
金币: 13839.4
红花: 6
帖子: 1337
在线: 364.4小时
虫号: 940728
注册: 2010-01-11
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:40:11

分析了这么多原因还做不出来。
有个疑问是酶切后的片段跑电泳亮不亮？
载体酶切很容易看出是否没酶切完全（分别作单酶切看看条带大小）
就是PCR片段酶切可能出问题。（不知道你片段上有没有加保护碱基，如果没有，肯定切不出来）
实在不行，可以将你PCR片段纯化后（普通taq酶），与T载体连接，转化到大肠杆菌中，扩增，抽质粒，然后再进行酶切，回收目的片段。（有时候有些酶的保护碱基要求比较严格，通过PCR方法加保护碱基不是很现实，可以通过该方法使酶切变得容易）
最后预祝实验成功。