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wangmin2010

新虫 (小有名气)

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虫号: 1197771
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性别: MM

[求助] 原核载体构建

求助：
我现在在构建一个原核载体，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI这两个酶，我一直用的传统的方法，可就是连不上，PCR回收在酶切，质粒酶切，单酶切，都试过了，就是连不上，请问高手们，有没有遇到过这样的问题啊1

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自己的人生是要靠自己改变的！

1楼 2012-07-31 19:39:49

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84146922

金虫 (小有名气)

MolEPI: 2
应助: 42 (小学生)
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性别: GG
专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励热心积极交流 2012-08-02 15:39:52

个人有些想法：
1.先确保载体被切开，分别用你的两种酶单酶切，双酶切，然后跑胶，没有问题再往下做。
2.再确认下酶的说明书，PCR产物有些要求，是要切久一点的，不过，你切4h,应该够了。回收后的效率如何，PCR产物有多大？胶回收试剂盒的分辨率可以达到吗？
3.确保连接酶没有问题，我就试过一次连接酶坏了，做几次都没有出来。连接体系中，载体与目的片段如何？
4.确认感受态木有问题.
希望对你有帮助！