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pushizi木虫 (小有名气)
pushizi
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[求助]
酿酒酵母高效感受态制备
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最近一直都用电击转化进行酿酒酵母的DNA片段转化，转了好几次都没有出来。 具体过程为： 1. 挑取单菌落于3-5 ml培养基中，30℃，200 rpm，过夜培养12-16 h 2. 1：50比例接种于50 ml培养基中（250 ml瓶子），30℃，200 rpm，培养5-5.5 h，至OD值为0.8左右 3. 细胞冰浴10 min，1600 g离心5 min。 4. 弃上清，加入4℃，50 ml无菌水洗涤一遍。 5. 弃上清，加入4℃，50 ml 1M山梨醇洗涤一遍。 6. 弃上清，加入4℃，25 ml 1M山梨醇洗涤一遍。 7. 弃上清，采用1M山梨醇重悬细胞，最终定容至150 ul左右。 8. 取50 ul细胞加入<5 ul DNA片段，电击。电击参数为1500 v。电击时间为5-6 ms。 9. 电击后加入1 ml 1M山梨醇，温浴2 h，全部离心涂平板。 生长2-3天后观察。 现在出现的问题是： 1. 负对照（就是转化时不加DNA）的也能够生长几个出来（5-10个）。负对照的菌液离心全涂。 2. 转化的样品也是离心全涂，也就长10-15个左右。很纠结，这个到底要不要鉴定啊。。。。。 3. 转化过程有什么地方不正确么？为什么做的效率都不高。我以相同的条件做酿酒酵母质粒的转化，大概能生长100 个左右，为什么片段转化效率这么低。 4. 有没有其他效率高一点的转化方法推荐？这个都做好多遍了。。。。。。还是哪里技巧没有注意到？ 望高人指教！ |
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