| 查看: 1420 | 回复: 5 | ||
pushizi木虫 (小有名气)
pushizi
|
[求助]
酿酒酵母高效感受态制备
|
|
最近一直都用电击转化进行酿酒酵母的DNA片段转化，转了好几次都没有出来。 具体过程为： 1. 挑取单菌落于3-5 ml培养基中，30℃，200 rpm，过夜培养12-16 h 2. 1：50比例接种于50 ml培养基中（250 ml瓶子），30℃，200 rpm，培养5-5.5 h，至OD值为0.8左右 3. 细胞冰浴10 min，1600 g离心5 min。 4. 弃上清，加入4℃，50 ml无菌水洗涤一遍。 5. 弃上清，加入4℃，50 ml 1M山梨醇洗涤一遍。 6. 弃上清，加入4℃，25 ml 1M山梨醇洗涤一遍。 7. 弃上清，采用1M山梨醇重悬细胞，最终定容至150 ul左右。 8. 取50 ul细胞加入<5 ul DNA片段，电击。电击参数为1500 v。电击时间为5-6 ms。 9. 电击后加入1 ml 1M山梨醇，温浴2 h，全部离心涂平板。 生长2-3天后观察。 现在出现的问题是： 1. 负对照（就是转化时不加DNA）的也能够生长几个出来（5-10个）。负对照的菌液离心全涂。 2. 转化的样品也是离心全涂，也就长10-15个左右。很纠结，这个到底要不要鉴定啊。。。。。 3. 转化过程有什么地方不正确么？为什么做的效率都不高。我以相同的条件做酿酒酵母质粒的转化，大概能生长100 个左右，为什么片段转化效率这么低。 4. 有没有其他效率高一点的转化方法推荐？这个都做好多遍了。。。。。。还是哪里技巧没有注意到？ 望高人指教！ |
回复此楼» 猜你喜欢
假如你的研究生提出不合理要求
已经有4人回复
-
论文终于录用啦！满足毕业条件了
已经有27人回复
-
所感
已经有3人回复
-
要不要辞职读博？
已经有7人回复
-
不自信的我
已经有11人回复
-
北核录用
已经有3人回复
-
实验室接单子
已经有3人回复
-
磺酰氟产物，毕不了业了！
已经有8人回复
-
求助:我三月中下旬出站，青基依托单位怎么办？
已经有10人回复
-
26申博（荧光探针方向，有机合成）
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 酿酒酵母破胞问题求助
已经有21人回复
- 新制备的感受态细胞
已经有7人回复
- 请问制备的电转化的感受态细胞可以用于化学转化操作吗？
已经有3人回复
- 如何将质粒转入酿酒酵母啊
已经有16人回复
- Cacl2法制备的感受态竟然有抗性？
已经有23人回复
- 什么是酵母转化
已经有4人回复
- 如何从平板上看酵母转化子是否是酵母
已经有9人回复
- 革兰氏阳性菌感受态的制备及转化
已经有14人回复
- 制作超级电转感受态注意事项
已经有8人回复
- 大肠杆菌DH5α感受态制备
已经有21人回复
- 电转感受态用多大电压
已经有7人回复
- DH5a 感受态细胞制备问题
已经有17人回复
- 求助一个关于酿酒酵母转化的问题
已经有19人回复
- 酿酒酵母转化建立突变库
已经有13人回复
- 重组酿酒酵母转化子筛选的问题
已经有12人回复
- 急求酿酒酵母的电转感受态制备方法和转化方法
已经有13人回复
- 20金币 求助关于酿酒酵母的放大培养
已经有9人回复
- 感受态的制备及转化？
已经有13人回复
- 【求助/交流】酵母培养
已经有27人回复
- 【专题】------------------感受态、转化专题------------------
已经有24人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母利用半乳糖的问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于制备感受态细胞的重悬问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】求助：酵母感受态细胞的制备
已经有9人回复
- 【求助/交流】感受态细胞的制备
已经有18人回复
pushizi
木虫 (小有名气)
pushizi
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 5675.3
- 散金: 120
- 帖子: 218
- 在线: 63.6小时
- 虫号: 816313
- 注册: 2009-07-26
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
2楼2012-07-30 08:08:54
3楼2012-11-19 21:39:12
4楼2014-03-29 09:06:57
pushizi
木虫 (小有名气)
pushizi
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 5675.3
- 散金: 120
- 帖子: 218
- 在线: 63.6小时
- 虫号: 816313
- 注册: 2009-07-26
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
5楼2014-03-29 14:47:26
aixiachun
铜虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 30.6
- 散金: 4
- 帖子: 80
- 在线: 120小时
- 虫号: 3257552
- 注册: 2014-06-05
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2016-03-13 10:33:23