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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有做过荧光定量PCR的吗？
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小石头2007

金虫 (正式写手)

[交流] 有做过荧光定量PCR的吗？ 已有7人参与

我要准备做荧光定量PCR，目的基因长度136bp，用普通PCR扩增，目的条带单一，没有非特异性扩增，但是引物二聚体比较多。这样的引物用来做荧光定量效果会好吗？
再有，提取的RNA质量对于后期荧光定量PCR有影响吗？我提的RNA的OD260/280比值在1.8-2.0之间，但是OD260/230的比值一直偏小，大概在1左右。这样的RNA能用来反转录，并作荧光定量PCR吗？

[ Last edited by 小石头2007 on 2012-8-23 at 20:44 ]
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1楼 2012-07-25 15:12:42
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chlorella409

木虫 (正式写手)
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wizardfan: 金币+2, 经验之谈 2012-08-19 04:46:20
要看你荧光定量用什么方法了，SYBR的话绝对不可以，引物二聚体也会有很强的荧光信号，用探针的话，只要探针设计得当，引物二聚体对此是不会有影响的
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2楼2012-07-25 16:59:00
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小石头2007

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-07-25 16:59:00
要看你荧光定量用什么方法了，SYBR的话绝对不可以，引物二聚体也会有很强的荧光信号，用探针的话，只要探针设计得当，引物二聚体对此是不会有影响的

我用的就是SYBR
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3楼2012-07-27 13:57:07
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chlorella409

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 小石头2007 at 2012-07-27 13:57:07
我用的就是SYBR...

那你还是赶快换引物吧，SYBR只要有扩增就会发出荧光，不管是你目的片段还是引物二聚体，他没有特异性的，我们之前做的时候也是发现有引物二聚体，就放弃这种方法了
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4楼2012-07-27 14:18:02
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lanhanh

新虫 (初入文坛)
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看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-08-19 08:27:22
real time pcr 算是比较容易的吧 我以前作的死SYBR
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5楼2012-07-27 16:53:55
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zhudongyang

新虫 (初入文坛)
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看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-08-19 08:27:27
用SYBR做real time pcr   引物至关重要，建议多设计几对引物，再进行筛选
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6楼2012-08-18 22:09:28
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snowsun04006
7楼2012-09-29 04:09:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-09-29 09:46:39
引物很重要，引物二聚体对结果影响很大，做出的CT值数根本不准。多设计几对引物选一对最好的做。RNA的质量还是很重要的。经过DNase处理后A260/280~2。如果DNA处理不干净是不行的，做反转录的时候要做负对照。A260/230最好在2，就我的经验来看，稍微低一点问题不是很大。
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8楼2012-09-29 09:20:26
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-09-29 09:46:46
楼主，你可以做一下看，因为普通PCR 引物浓度是25mM左右，而QPCR引物浓度是3mM, 而二者的BUFFER 也不一样，即使普通PCR很好，QPCR也不一定就适用，而普通PCR结果不太好的引物做QPCR有时结果会很好。
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9楼2012-09-29 09:32:58
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于熊宝

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
RNA的OD260/280比值在1.8-2.0  说明RNA 浓度很高了。。。。  我做的最高也就达到过2,1
  PCR反应底物是DNA，，，RNA做RT-PCR得到的， 不是一回事   
  不过提取的RNA纯度  和 比值  均一 最重要
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to be , or not to be , that is a question...
10楼2012-09-29 20:57:58
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