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小石头2007

金虫 (正式写手)

[交流] 有做过荧光定量PCR的吗? 已有7人参与

我要准备做荧光定量PCR,目的基因长度136bp,用普通PCR扩增,目的条带单一,没有非特异性扩增,但是引物二聚体比较多。这样的引物用来做荧光定量效果会好吗?
再有,提取的RNA质量对于后期荧光定量PCR有影响吗?我提的RNA的OD260/280比值在1.8-2.0之间,但是OD260/230的比值一直偏小,大概在1左右。这样的RNA能用来反转录,并作荧光定量PCR吗?

[ Last edited by 小石头2007 on 2012-8-23 at 20:44 ]
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-09-29 09:46:39
引物很重要,引物二聚体对结果影响很大,做出的CT值数根本不准。多设计几对引物选一对最好的做。RNA的质量还是很重要的。经过DNase处理后A260/280~2。如果DNA处理不干净是不行的,做反转录的时候要做负对照。A260/230最好在2,就我的经验来看,稍微低一点问题不是很大。
8楼2012-09-29 09:20:26
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chlorella409

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 经验之谈 2012-08-19 04:46:20
要看你荧光定量用什么方法了,SYBR的话绝对不可以,引物二聚体也会有很强的荧光信号,用探针的话,只要探针设计得当,引物二聚体对此是不会有影响的
2楼2012-07-25 16:59:00
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小石头2007

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-07-25 16:59:00
要看你荧光定量用什么方法了,SYBR的话绝对不可以,引物二聚体也会有很强的荧光信号,用探针的话,只要探针设计得当,引物二聚体对此是不会有影响的

我用的就是SYBR
3楼2012-07-27 13:57:07
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chlorella409

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小石头2007 at 2012-07-27 13:57:07
我用的就是SYBR...

那你还是赶快换引物吧,SYBR只要有扩增就会发出荧光,不管是你目的片段还是引物二聚体,他没有特异性的,我们之前做的时候也是发现有引物二聚体,就放弃这种方法了
4楼2012-07-27 14:18:02
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