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758836596

铜虫 (初入文坛)

[求助] pMAL载体表达重组蛋白

最近在做蛋白表达,载体选择的是pMAL,目的片段是自己设计的一段300多bp的片段,质粒构建成功之后蛋白就是表达不出来,宿主菌试了TB1和BL21,诱导温度试了37,30,16,IPTG也试了各种浓度,结果还是诱导不出来,请问有什么别的办法啊?谢谢各位了。
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 虫虫最近很活跃哦,谢谢对分子版的支持 2012-07-03 15:36:20
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:02:17
表达不出来的原因很多的,宿主菌跟诱导条件是一方面,另一方面要考虑你扩增的目的片段是否完整?有无表达先例,这个可以参照一些文献,还有你目标片段的稀有密码子是否检测过,如果连续出现稀有密码子,可能会造成翻译中断,这也会造成蛋白表达的失败,如果是这个情况就需要更换专门表达稀有密码子过多的宿主细胞.
建议楼主多从表达载体和目的片段的结构入手,祝楼主好运.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-02 21:48:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 758836596 at 2012-07-03 13:33:25
是有稀有密码子,但是连续出现时什么意思啊?中间隔几个密码子之后再出现的话算是连续吗?还有,专门表达稀有密码子过多的宿主细胞都有哪些啊?...

连续的AT或者GC
宿主细胞可以选择Rosetta系列的菌株
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
7楼2012-07-03 13:43:54
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普通回帖
3楼2012-07-03 10:46:02
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bayo

禁虫 (初入文坛)

小丹木木: 屏蔽内容, 广告屏蔽 2012-07-03 15:36:51
本帖内容被屏蔽

4楼2012-07-03 11:49:58
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758836596

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-07-03 10:46:02

5楼2012-07-03 13:29:33
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758836596

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-02 21:48:45
表达不出来的原因很多的,宿主菌跟诱导条件是一方面,另一方面要考虑你扩增的目的片段是否完整?有无表达先例,这个可以参照一些文献,还有你目标片段的稀有密码子是否检测过,如果连续出现稀有密码子,可能会造成翻 ...

是有稀有密码子,但是连续出现时什么意思啊?中间隔几个密码子之后再出现的话算是连续吗?还有,专门表达稀有密码子过多的宿主细胞都有哪些啊?
6楼2012-07-03 13:33:25
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758836596

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Marado at 2012-07-03 13:43:54
连续的AT或者GC
宿主细胞可以选择Rosetta系列的菌株...

谢谢啦,实在不行我就试试吧。
8楼2012-07-03 17:24:48
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plumplumgxc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是构建载体时用的序列的问题,pMal应该不难做的。回头检查一下是不是有低级错误
科研这条道不好走啊。。。
9楼2012-07-04 10:57:00
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758836596

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by plumplumgxc at 2012-07-04 10:57:00
应该是构建载体时用的序列的问题,pMal应该不难做的。回头检查一下是不是有低级错误

好的,谢谢啦,我回头仔细核对一下。
10楼2012-07-04 19:09:46
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