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WSW_Alone木虫 (著名写手)
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试剂盒提取细菌DNA后，跑胶检测有条带，但是PCR后却无扩增产物。
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如题，土壤筛选的菌，用试剂盒提取DNA后，跑胶检测（如图）有条带，进行16S rDNA PCR扩增，结果却没有。请教一下哪里出了问题？（注：上一批也是这么做的，大部分都跑出来了，不知道为何这次都没出来，条件什么的都一样） 体系是通用的，我用的引物是27f/1492r 扩增条件：94℃ 5min 94℃ 45s 56℃ 45s 72℃ 90s 32个循环 72℃ 20min 求大神指导，不胜感激。  试剂盒提取DNA后直接跑胶检测结果  PCR产物跑胶结果 |
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 土壤微生物 |
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dakang87
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4楼2012-07-02 13:08:44
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+4, ★★★很有帮助, 言之有理，考虑加一个之前扩增出来了的菌进行对照。 2012-06-28 11:04:23
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-28 15:43:41
WSW_Alone: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 设置阳性对照发现应该是试剂出了点问题，还是我自己做实验不够严谨，多谢多谢。 2012-07-03 20:12:51
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-28 15:43:41
WSW_Alone: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 设置阳性对照发现应该是试剂出了点问题，还是我自己做实验不够严谨，多谢多谢。 2012-07-03 20:12:51
| 这个可能因素非常多。建议设一个正对照，提取单一菌株基因组，用来检测你的pcr体系。要是能出说明是你提取基因组的问题。基因组中可能有抑制pcr的成分。 |
3楼2012-06-27 20:48:22
xiadongliang
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5楼2012-07-03 08:28:29
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WSW_Alone
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设置阳性对照和空白对照（排除试剂失效或污染的情况） 如果扩增不出来再对退火温度进行梯度实验，确定一个合适的温度（可以扩增，且非特异性扩增少） 还不行的话考虑加些增强剂或直接用premix（我后面基本上用预混液了。 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2017-01-16 08:39:48
20