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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 试剂盒提取细菌DNA后，跑胶检测有条带，但是PCR后却无扩增产物。
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WSW_Alone

木虫 (著名写手)

[求助] 试剂盒提取细菌DNA后，跑胶检测有条带，但是PCR后却无扩增产物。

如题，土壤筛选的菌，用试剂盒提取DNA后，跑胶检测（如图）有条带，进行16S rDNA PCR扩增，结果却没有。请教一下哪里出了问题？（注：上一批也是这么做的，大部分都跑出来了，不知道为何这次都没出来，条件什么的都一样）
体系是通用的，我用的引物是27f/1492r
扩增条件：94℃    5min
                94℃    45s
                56℃    45s
                72℃    90s
                 32个循环
          72℃    20min
求大神指导，不胜感激。

试剂盒提取DNA后直接跑胶检测结果



PCR产物跑胶结果
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處世樹為模，本固任從枝葉動；立身錢作樣，內方還要外邊圓。
1楼 2012-06-27 16:52:35
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dakang87

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

补充点：模板做个梯度稀释试一下~
赞一下(2人) 回复此楼
拼了吧
4楼2012-07-02 13:08:44
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necilyx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+2, ★★★很有帮助, 之前的引物二聚体也有的，考虑换新试剂。 2012-06-28 11:03:24
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-28 15:43:32
试剂有没有过期，试剂换新的，引物重新稀释，枪头都灭灭菌，之前相同体系没问题的话，看着图貌似有不少二聚体~~感觉像是引物的问题~
赞一下 回复此楼
聪明才智要为意外做准备~~
2楼2012-06-27 17:10:16
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
WSW_Alone: 金币+4, ★★★很有帮助, 言之有理，考虑加一个之前扩增出来了的菌进行对照。 2012-06-28 11:04:23
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-28 15:43:41
WSW_Alone: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 设置阳性对照发现应该是试剂出了点问题，还是我自己做实验不够严谨，多谢多谢。 2012-07-03 20:12:51
这个可能因素非常多。建议设一个正对照，提取单一菌株基因组，用来检测你的pcr体系。要是能出说明是你提取基因组的问题。基因组中可能有抑制pcr的成分。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-06-27 20:48:22
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

DNA稀释下，看你的DNA的图，稀释100倍也可以进行PCR。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2012-07-03 08:28:29
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