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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解：实时荧光定量PCR奇峰
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)

[交流] 求解：实时荧光定量PCR奇峰已有8人参与

求高人指点，最近在做定量PCR，阳性扩增曲线很好，可是阴性也有峰型。阴性Ct值在36以上，而且阳性和阴性Ct值相差很大，这样的结果怎么判定？
重复了好几次，阴性都是在36以后起峰，引物、模板都换了，依然是这个结果···
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
1楼2012-06-20 09:11:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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小丹木木: 金币+3, 斑斑很辛苦哈 2012-06-20 15:35:34
阴性的Ct值在35以上就可以认为没问题了。微弱的非特异结合（错配、二聚体等）在多个循环之后可能有一些扩增的，如果阴性对照在35个循环之后才出现的扩增，一般认为是正常的。楼主不放心的话，可以把阴性对照的产物拿去跑胶，没有特异条带的话就没问题了，当然，可能有弥散的带，那是非特异扩增的产物。
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10楼2012-06-20 15:31:32
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l_h_10

金虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-20 15:34:56
你的阴性是没加什么？如果是加了引物，没加模版的话，有可能是引物污染了。（引物是在超净工作台里稀释的吗？）还有你用的是什么的试剂盒？如果是takara的试剂盒的话，也没有关系了，他们试剂盒的本底值比较高，我们也出现过这个问题，就咨询过技术员，takara的技术员说只要在35个循环之后出峰是没有问题的。
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2楼2012-06-20 09:40:02
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-20 15:35:05
水也很重要，看看你的水是否有问题。还有就是你的阳性的溶解曲线如何？是单峰还是双峰？如果阳性没有任何问题，而NTC有扩增也是可以的，只要其ct值在35个循环之后。
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一切都要靠自己努力
3楼2012-06-20 11:24:29
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)
★
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我记得阴性阳性ct差7以上就可以忽略了，你的达到这个标准了吗？达到了就不要太纠结于阴性的峰了
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4楼2012-06-20 12:44:38
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l_h_10 at 2012-06-20 09:40:02
你的阴性是没加什么？如果是加了引物，没加模版的话，有可能是引物污染了。（引物是在超净工作台里稀释的吗？）还有你用的是什么的试剂盒？如果是takara的试剂盒的话，也没有关系了，他们试剂盒的本底值比较高，我们 ...

我的阴性对照加了引物，模板用去离子水代替。但是引物稀释没有在超净工作台稀释，这个影响大吗？我们用的是invitrogen试剂盒···
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
5楼2012-06-20 13:58:56
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiayongxiu at 2012-06-20 11:24:29
水也很重要，看看你的水是否有问题。还有就是你的阳性的溶解曲线如何？是单峰还是双峰？如果阳性没有任何问题，而NTC有扩增也是可以的，只要其ct值在35个循环之后。

水没有问题，阳性曲线单峰，而且峰型也很好看，NTC有扩增，可是根据标准，如果在35个循环后还是起峰就判定是阳性，这样明显有问题啊··········
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
6楼2012-06-20 14:00:31
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaoyonggang at 2012-06-20 12:44:38
我记得阴性阳性ct差7以上就可以忽略了，你的达到这个标准了吗？达到了就不要太纠结于阴性的峰了

达到了，那这样就可以判定是阴性了吗？求解···
而且其它的引物都没有问题，阴性很干净，不会出现峰型。
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7楼2012-06-20 14:01:51
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l_h_10

金虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-21 13:38:57
这个影响我也说不准吧，反正我们做RT-PCR的话，所有东西都是在超净工作台里做的，目的就是问了避免有外源性DNA混入引物，引起扩增。
你可以打电话给invitrogen 技术人员，他们有的时候会有很好的建议的。
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8楼2012-06-20 14:36:51
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by 欧朵拉 at 2012-06-20 14:01:51
达到了，那这样就可以判定是阴性了吗？求解···
而且其它的引物都没有问题，阴性很干净，不会出现峰型。...

超过7以上就意味着阴性是阳性的0.5%以下（假设你的引物扩增效率是2），已经很干净了。
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9楼2012-06-20 15:09:24
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