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欧朵拉

铁虫 (小有名气)

[交流] 求解:实时荧光定量PCR奇峰 已有8人参与

求高人指点,最近在做定量PCR,阳性扩增曲线很好,可是阴性也有峰型。阴性Ct值在36以上,而且阳性和阴性Ct值相差很大,这样的结果怎么判定?
重复了好几次,阴性都是在36以后起峰,引物、模板都换了,依然是这个结果···
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 斑斑很辛苦哈 2012-06-20 15:35:34
阴性的Ct值在35以上就可以认为没问题了。微弱的非特异结合(错配、二聚体等)在多个循环之后可能有一些扩增的,如果阴性对照在35个循环之后才出现的扩增,一般认为是正常的。楼主不放心的话,可以把阴性对照的产物拿去跑胶,没有特异条带的话就没问题了,当然,可能有弥散的带,那是非特异扩增的产物。
10楼2012-06-20 15:31:32
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l_h_10

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-20 15:34:56
你的阴性是没加什么?如果是加了引物,没加模版的话,有可能是引物污染了。(引物是在超净工作台里稀释的吗?)还有你用的是什么的试剂盒?如果是takara的试剂盒的话,也没有关系了,他们试剂盒的本底值比较高,我们也出现过这个问题,就咨询过技术员,takara的技术员说只要在35个循环之后出峰是没有问题的。
2楼2012-06-20 09:40:02
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-20 15:35:05
水也很重要,看看你的水是否有问题。还有就是你的阳性的溶解曲线如何?是单峰还是双峰?如果阳性没有任何问题,而NTC有扩增也是可以的,只要其ct值在35个循环之后。
一切都要靠自己努力
3楼2012-06-20 11:24:29
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我记得阴性阳性ct差7以上就可以忽略了,你的达到这个标准了吗?达到了就不要太纠结于阴性的峰了
4楼2012-06-20 12:44:38
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