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[求助] 野生型大肠杆菌外源蛋白表达量不稳定的问题

如题，小弟用野生型大肠杆菌表达一淀粉酶基因，质粒为pKK，启动子为Tac启动子。该蛋白能在野生型大肠杆菌中获得表达，但酶活很低，SDS-PAGE无可见目的蛋白条带，且每批摇瓶酶活不稳定。在这里求助各位高手，希望能找出原因得到稳定酶活。具体试验过程如下：
从LB平板接种有淀粉酶基因的重组大肠杆菌（单菌落），至液体LB（50mL）培养基中（氨苄青霉素抗性为50uM）。37℃, 200rpm培养至OD600为0.8，以终浓度为0.1mM加入IPTG，转入16℃, 150rpm培养。12h后收集细胞，超声破碎，测酶活。
做过多批试验，酶活高时有356个单位，低时只有45个单位。每批实验均在相同条件下进行。从-70度接种新菌做发酵酶活也较低，只有100个单位；而在4度放置10天的菌做发酵也出现过300+单位的酶活，因此可以排除菌株退化的原因。超声破碎时条件均一致，破碎液温度能维持在较低状态，因此也可以排除超声破碎时温度太高导致蛋白变性的原因。破碎后，菌液都较澄清，都破碎的比较完全，因此排除破碎程度不同的原因。另外诱导温度试过25度，IPTG浓度为0.5mM，但形成包涵体，细胞破碎液上清中的酶活很低，几乎检测不到，所以降低温度到16度，150rpm，IPTG为0.1mM。
现在小弟有几点疑问：
1、大肠不经过种子培养基，接种单菌落到液体LB直接发酵，是否会导致每批菌体转诱导时生长状态不同而导致酶活不一？影响有这么大吗?
2、大肠在培养过程会会不会出现重组质粒在其内拷贝数不稳定的情况？有没有办法控制？
3、细胞破碎液上清SDS-PAGE检测不到目的条带，证明可溶性蛋白量太小，是因为形成了包涵体还是因为本身表达量太低？
4、这个淀粉酶对大肠杆菌有毒性，重组菌的生长速度明显慢于空菌对照。这个蛋白表达在大肠杆菌内会不会被降解？
非常感谢大家的帮助！

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1楼 2012-06-16 15:16:07

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银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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x452659189: 回帖置顶 2012-06-19 19:14:46

1、大肠不经过种子培养基，接种单菌落到液体LB直接发酵，是否会导致每批菌体转诱导时生长状态不同而导致酶活不一？影响有这么大吗?
会！最好做二次活化。
2、大肠在培养过程会会不会出现重组质粒在其内拷贝数不稳定的情况？有没有办法控制？
正常情况下，只要抗生素的筛选压力在就不会不稳定。
3、细胞破碎液上清SDS-PAGE检测不到目的条带，证明可溶性蛋白量太小，是因为形成了包涵体还是因为本身表达量太低？
野生型菌表达量低是很正常的，SDS-PAGE同时跑全细胞样品和上清样品就可以看到是否形成包涵体。
4、这个淀粉酶对大肠杆菌有毒性，重组菌的生长速度明显慢于空菌对照。这个蛋白表达在大肠杆菌内会不会被降解？
生长慢正常，可以在培养基里加一点葡萄糖既可以降低背景表达有可以帮助细胞生长。破碎前加蛋白酶抑制剂。

另外：低温表达的时间太短了，我们一般18度要表达24h到96h，可以适当延长下。