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x452659189金虫 (小有名气)
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[求助]
野生型大肠杆菌外源蛋白表达量不稳定的问题
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如题，小弟用野生型大肠杆菌表达一淀粉酶基因，质粒为pKK，启动子为Tac启动子。该蛋白能在野生型大肠杆菌中获得表达，但酶活很低，SDS-PAGE无可见目的蛋白条带，且每批摇瓶酶活不稳定。在这里求助各位高手，希望能找出原因得到稳定酶活。具体试验过程如下： 从LB平板接种有淀粉酶基因的重组大肠杆菌（单菌落），至液体LB（50mL）培养基中（氨苄青霉素抗性为50uM）。37℃, 200rpm培养至OD600为0.8，以终浓度为0.1mM加入IPTG，转入16℃, 150rpm培养。12h后收集细胞，超声破碎，测酶活。 做过多批试验，酶活高时有356个单位，低时只有45个单位。每批实验均在相同条件下进行。从-70度接种新菌做发酵酶活也较低，只有100个单位；而在4度放置10天的菌做发酵也出现过300+单位的酶活，因此可以排除菌株退化的原因。超声破碎时条件均一致，破碎液温度能维持在较低状态，因此也可以排除超声破碎时温度太高导致蛋白变性的原因。破碎后，菌液都较澄清，都破碎的比较完全，因此排除破碎程度不同的原因。另外诱导温度试过25度，IPTG浓度为0.5mM，但形成包涵体，细胞破碎液上清中的酶活很低，几乎检测不到，所以降低温度到16度，150rpm，IPTG为0.1mM。 现在小弟有几点疑问： 1、大肠不经过种子培养基，接种单菌落到液体LB直接发酵，是否会导致每批菌体转诱导时生长状态不同而导致酶活不一？影响有这么大吗? 2、大肠在培养过程会会不会出现重组质粒在其内拷贝数不稳定的情况？有没有办法控制？ 3、细胞破碎液上清SDS-PAGE检测不到目的条带，证明可溶性蛋白量太小，是因为形成了包涵体还是因为本身表达量太低？ 4、这个淀粉酶对大肠杆菌有毒性，重组菌的生长速度明显慢于空菌对照。这个蛋白表达在大肠杆菌内会不会被降解？ 非常感谢大家的帮助！ |
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