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auau96

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间 已有2人参与

大家好  我现在在做酿酒酵母基因敲除  利用左右同源臂各390bp和540bp  因为本身菌株遗传背景不清楚  MARKER基因既不是抗性基因和也不是缺陷型基因     用能表达的酶基因做筛选标记   不知各位前辈是否有此类实验经验来敲除目的基因   
实验顺利大概需多少时间能完成
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zyly605

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-05 15:23:20
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路:利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 ...

我也做过酵母菌株的基因敲出,当时使用G418作为筛选标记。但是不太了解你的这种思路,想和你交流下,如果你选用要表达的酶做基因筛选标记,说明这个酶本来酵母是不产生的,并且你每次筛选都得测酶活或蛋白电泳?是这个意思吗
13楼2012-06-07 13:39:40
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zyly605

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:10:02
谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转 ...

可以对构建的重组质粒进行下测序就可以知道是否突变了,我当时是这样的。
14楼2012-06-07 13:42:10
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