| 查看: 710 | 回复: 1 | ||
kabuqinuo89新虫 (小有名气)
|
[求助]
测序后证明克隆出非目的基因
|
|
我要做原核表达。 实验一开始是很顺利的，PCR得到目的基因片段（1000bp左右），回收，连接T载体，转化，最后提质粒，做酶切和PCR鉴定，都和目的片段相吻合，电泳跑出的条带也很不错。 可测序结果与我的参考序列一比对，完全不是目的片段，查找引物时,也只找到下游引物。 这足以说明我做出的东西完全不是我需要的。 我想是不是我的引物特异性不好？这对引物是从一篇文章中直接引用的。于是又用oligo分析了一下我的引物，各项指标都还可以，应该特异性很高的。实验中采用的退火温度也是完全按oligo的建议温度。 实验进行到这一步，我不知从什么地方找原因了。究竟哪会出问题呢？这是己经有人做过的，并且做出来了，有文章可查（国外的），为什么我做不出来呢？ 下一步该怎么做，是不是需要从头再来，哪些地方要做什么样的调整？心里真是没谱儿…… 请各位老师帮帮我，在此先谢过了。 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有133人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 微卫星标记开发过程送测序的阳性克隆如何
已经有4人回复
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
已经有16人回复
- 【求助/交流】质粒测序测不到克隆位点
已经有16人回复
- 【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来
已经有11人回复
- 【求助/交流】各位大侠：我最近克隆一转运蛋白基因，假如基因成功克隆
已经有13人回复
- 【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？
已经有27人回复
- 【求助/交流】目的基因克隆总不成功
已经有5人回复
- 【求助/交流】克隆测序无信号
已经有14人回复
- 【求助/交流】关于目的基因的克隆
已经有12人回复
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，鼓励交流哦。顺便说一下，第一个猫猫也是我最喜欢的。 2012-05-23 13:56:12
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，鼓励交流哦。顺便说一下，第一个猫猫也是我最喜欢的。 2012-05-23 13:56:12
|
嗯..................... 我觉得要是做验证的时候 不仅要做PCR还要酶切一下看看 这样才可靠 引物问题最好设计前BLAST一下 看有没有不同种之间的非特异扩增 这种事几率很小 但遇到了只能让人哭 前些日子 本实验某人就遇到你这种情况 测序结果再BLAST发现东西是人皮肤上的某种蛋白.............老板脸色很难看 不注意预防污染就泪奔了  遇到这种情况 只能从头来了 还是预祝孩子实验顺利吧 没有搞不定的实验的  |
2楼2012-05-22 22:58:30