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kabuqinuo89新虫 (小有名气)
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测序后证明克隆出非目的基因
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我要做原核表达。 实验一开始是很顺利的，PCR得到目的基因片段（1000bp左右），回收，连接T载体，转化，最后提质粒，做酶切和PCR鉴定，都和目的片段相吻合，电泳跑出的条带也很不错。 可测序结果与我的参考序列一比对，完全不是目的片段，查找引物时,也只找到下游引物。 这足以说明我做出的东西完全不是我需要的。 我想是不是我的引物特异性不好？这对引物是从一篇文章中直接引用的。于是又用oligo分析了一下我的引物，各项指标都还可以，应该特异性很高的。实验中采用的退火温度也是完全按oligo的建议温度。 实验进行到这一步，我不知从什么地方找原因了。究竟哪会出问题呢？这是己经有人做过的，并且做出来了，有文章可查（国外的），为什么我做不出来呢？ 下一步该怎么做，是不是需要从头再来，哪些地方要做什么样的调整？心里真是没谱儿…… 请各位老师帮帮我，在此先谢过了。 |
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atlanticwi
金虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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嗯..................... 我觉得要是做验证的时候 不仅要做PCR还要酶切一下看看 这样才可靠 引物问题最好设计前BLAST一下 看有没有不同种之间的非特异扩增 这种事几率很小 但遇到了只能让人哭 前些日子 本实验某人就遇到你这种情况 测序结果再BLAST发现东西是人皮肤上的某种蛋白.............老板脸色很难看 不注意预防污染就泪奔了  遇到这种情况 只能从头来了 还是预祝孩子实验顺利吧 没有搞不定的实验的  |
2楼2012-05-22 22:58:30
