24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xianzhaozhao

木虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 2996.7
帖子: 216
在线: 19.6小时
虫号: 325264
注册: 2007-03-17
性别: GG
专业: 中兽医学

[求助] 脾脏总RNA提取及RT-PCR

第一次接触分子试验，不顺利，说出来请大家帮忙指点一下。
我试验的目的是牛akirin 2基因克隆与表达。具体操作如下：
1，去宰牛场等着采牛脾，牛从放血后经剥皮到脾脏采出大概50分钟，拿到脾脏后用剪刀剪碎，锡箔纸包裹，迅速放于液氮中。
2.用天根 Trizol A+ 试剂盒提取脾脏总RNA，取出脾脏后敲碎，取一小块在玻璃匀浆器中加trizol匀浆，在冰上，另一种方法是加Trizol ，用电动匀浆器匀浆，其余步骤按照试剂盒步骤操作，获得总RNA。
3.将电泳槽清洗H2O2处理，让后用DEPC水处理，电泳液和胶都是DEPC处理水新配，1%的胶，电压110，时间15分钟。结果如图，貌似有两条很浅的条带，，猜测可能是rna，但是最前边有很个亮疙瘩，是不是降解了。
4.用天根的试剂盒合成CDNA第一链。
5.然后进行PCR，上游引物：5' GAATTCGTGGAAGAGTCAGACAGTGCAGG 3'
下游引物：5' GGATCCTTGGAATCAGAACTCAGTTTATG 3'
退火温度试过60，58，55，都没有目标条带出来。
我得叙述是否清楚，该实验如何进行试验改进，问题出现在哪里？请各位不吝赐教，不胜感激。

回复此楼