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whyann

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR苦无结果

小弟最近PCR,苦无结果,也摸索了下条件,Mg2+浓度从0.5mM到15mM都是试过了,退火温度从45度到65度也做了梯度,我的引物For P:5-GCGCTACCGGACTCAGATC-3  Rev P:5-GATCTAGAGTCGCGGCCGC-3,还请高手指教,拜谢!!!Sample Text
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:40:21
whyann: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-04 22:30:45
引物肯定有问题,gc含量太高,退火温度必需高一些,65以上,
但愿人长久
2楼2012-05-04 08:34:57
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蚊在江湖

银虫 (小有名气)

我觉得有时候引物出不来就果断换一下引物
6楼2012-05-04 10:19:27
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syn1985

木虫 (正式写手)


西瓜: 金币+1, 鼓励交流~镁离子个人感觉影响也不大呢 2012-05-06 19:10:20
mg离子一般不用改浓度,改了没啥效果,看看引物和模板有没有问题,这两个才是王道。

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11楼2012-05-05 14:24:52
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普通回帖

SaG_W

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
whyann: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-04 22:31:30
从定引物试试,有时候合成的引物可能有问题,我以前也遇到过引物有问题。
3楼2012-05-04 09:19:57
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
whyann: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-04 22:31:42
引物GC含量太高,建议你另外选取一段来重新设计引物。
4楼2012-05-04 09:43:31
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bbcaaa888

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:42:40
whyann: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-04 22:32:22
刚上手做的时候不要着急,慢慢摸条件,但有些就不要做了,比如温度60度以下的退火温度,镁离子浓度高于4mM做了也没有多大意义
5楼2012-05-04 09:47:34
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lihengyang86

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by laojiu9878 at 2012-05-04 08:34:57:
引物肯定有问题,gc含量太高,退火温度必需高一些,65以上,

您好!请问引物的GC含量如果大于65%,是不是很难有效地扩增出目的片段。如果要是坚持使用这种引物,是不是要尽可能的提高退火温度来扩增?谢谢!
7楼2012-05-04 14:18:32
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whyann

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 蚊在江湖 at 2012-05-04 10:19:27:
我觉得有时候引物出不来就果断换一下引物

有道理
8楼2012-05-04 22:35:21
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whyann

银虫 (初入文坛)

内容已删除
9楼2012-05-04 22:35:45
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anzaigtt

木虫 (著名写手)

片段多长?
和长度有很大的关系
10楼2012-05-05 08:15:05
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