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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 透析后蛋白沉淀
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jamy1989

木虫 (小有名气)

[求助] 透析后蛋白沉淀

我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析复性，透析完后全部沉淀了，跑胶什么都没有！我透析的步骤是：
1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl   0.4M L-Arg    1mM EDTA   0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl   0.4M L-Arg    1mM EDTA   0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
3、binding buffer 20mM磷酸钠 500mM氯化钠 5mM咪唑 PH=7.6
各位看看问题出在哪里呢？我每步在4度冰箱透析了24个小时！是不是我的蛋白浓度太大了呢？还是我透析的步骤太少！？或者其它什么原因？急呀？？？
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qwdr
1楼 2012-04-23 09:34:22
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-04-23 19:59:12
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2012-04-24 15:02:35
我觉得你的浓度差拉太多了吧，中间在多增加几个梯度吧，不用每步都24h，在2-4M之间时间久一些就可，其余的6-12h可以的
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2012-04-23 11:13:57
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
蛋白最好是用来做啥的
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3楼2012-04-23 11:29:38
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
透析法复性只适用于一部分蛋白，有一些蛋白的复性是需要其他的复性条件的，并不是除去尿素就可以。如果有文献报道透析法可以，你按2楼的试试。
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4楼2012-04-23 11:56:41
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2012-04-24 15:04:39
5%甘油太低了  保护作用不明显   
梯度也拉的太大  一般复性过程在2M的时候发生   你直接跳过了2M
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hold住
5楼2012-04-23 12:58:16
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jamy1989: 金币+5 2012-04-24 15:06:00
透析的时候要加一定的还原剂的吧，比如DDT，β-me之类的
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6楼2012-04-23 13:17:02
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-04-23 11:29:38:
蛋白最好是用来做啥的

一种调控蛋白，用来试验调控机制的！
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qwdr
7楼2012-04-24 15:03:45
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zc10052157 at 2012-04-23 12:58:16:
5%甘油太低了  保护作用不明显   
梯度也拉的太大  一般复性过程在2M的时候发生   你直接跳过了2M

我试试！
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qwdr
8楼2012-04-24 15:04:30
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-23 13:17:02:
透析的时候要加一定的还原剂的吧，比如DDT，β-me之类的

还原剂浓度一般多大呢？ L-Arg应该起到这部分作用了吧！
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qwdr
9楼2012-04-24 15:05:55
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2012-04-27 16:52:18
许多蛋白中有Cys，且其中的－SH常作为活性中心发挥作用，或者两个－SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。－SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋白纯化和保存时，在溶液中加入一定量的还原剂，以免蛋白－SH被氧化而失活。浓度的话在2-5mM之间吧，还原剂还会降解，所以还要根据各自活性，按时间补加。L-Arg我没有使用过，不清楚具体什么作用。
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10楼2012-04-24 17:00:54
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