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jamy1989

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[求助] 透析后蛋白沉淀

我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析复性，透析完后全部沉淀了，跑胶什么都没有！我透析的步骤是：
1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
3、binding buffer 20mM磷酸钠 500mM氯化钠 5mM咪唑 PH=7.6
各位看看问题出在哪里呢？我每步在4度冰箱透析了24个小时！是不是我的蛋白浓度太大了呢？还是我透析的步骤太少！？或者其它什么原因？急呀？？？

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qwdr

1楼2012-04-23 09:34:22

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jamy1989

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3楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-04-23 11:29:38:
蛋白最好是用来做啥的

一种调控蛋白，用来试验调控机制的！

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qwdr

7楼2012-04-24 15:03:45

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5楼: Originally posted by zc10052157 at 2012-04-23 12:58:16:
5%甘油太低了保护作用不明显
梯度也拉的太大一般复性过程在2M的时候发生你直接跳过了2M

我试试！

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qwdr

8楼2012-04-24 15:04:30

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6楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-23 13:17:02:
透析的时候要加一定的还原剂的吧，比如DDT，β-me之类的

还原剂浓度一般多大呢？ L-Arg应该起到这部分作用了吧！

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9楼2012-04-24 15:05:55

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10楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-24 17:00:54:
许多蛋白中有Cys，且其中的－SH常作为活性中心发挥作用，或者两个－SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。－SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋 ...

我试试看！多谢帮助！

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12楼2012-04-27 16:52:32

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11楼: Originally posted by 鼓浪听涛 at 2012-04-25 13:24:36:
L-Arg主要是促进蛋白质溶解！

L-Arg不是能使不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，大幅提高包涵体蛋白的折叠效率吗？

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13楼2012-04-28 10:30:42

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jamy1989: 回帖置顶 2012-04-29 09:29:11

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2楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-04-23 11:13:57:
我觉得你的浓度差拉太多了吧，中间在多增加几个梯度吧，不用每步都24h，在2-4M之间时间久一些就可，其余的6-12h可以的

这次透析的蛋白溶度被我降低了！并且每升只透析20ml，我做了个对比试验：
1号瓶分别用4M 尿素、 1M尿素、binding buffer 透析！
2号瓶分别用4M 尿素、 2M尿素、1M尿素、0M尿素、binding buffer 透析！
结果1号瓶还是在用binding buffer透析是全部出现沉淀，取沉淀跑胶，能看到目的条带！
2号瓶也是在用binding buffer 透析是全部出现沉淀（大约在透析3个小时的时候就有很多沉淀了），和1号瓶一样！另外当2号瓶透析到0M结束时我取了一些样保留下来，跑胶能看到目的条带！
我在想是不是binding buffer 有问题呢？我底下准备用His-tag纯化蛋白，是不是一定要用binding buffer 透析呢？

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qwdr

15楼2012-04-29 09:28:23

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