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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆
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yitiandeng

木虫 (著名写手)

[求助] 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆

无连接酶亚克隆法，请亲们看好说明啊，别解释原理什么的

[ Last edited by yitiandeng on 2012-4-8 at 15:52 ]
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1楼 2012-04-08 15:50:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yitiandeng: 金币+30, 18 2012-04-08 20:19:37
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。
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5楼2012-04-08 19:52:20
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忧郁的骑士

银虫 (初入文坛)
英语叫restriction free clone，RF clone，PCR产物两端有酶切载体的同源系列，15bp左右，PCR产物和酶切载体同时转化感受态大肠杆菌，大肠杆菌进行同源重组修复，形成环状。我们实验室用这种方法克隆了一万多个质粒，建库。
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12楼2012-10-13 18:06:49
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
.........................
不明白你的意图是什么，具体应用方向就有具体的方法，你说清楚了才好解释啊
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-08 15:56:30
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！欢迎发表更多的见解！ 2012-04-08 17:13:26
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR 产物        3ul
25度反应半小时后，转化大肠杆菌。
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hehe
3楼2012-04-08 17:10:22
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-08 17:10:22:
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR ...

楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体系，你总共加起来只有5uL，反应半个小时，是会极大降低重组效率的，说明书一般推荐5min左右，随片段长度而改变，我们就是用3Kb的去连接也只用15min左右，所以朋友，要严谨
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Let God do with it as He wills
4楼2012-04-08 18:16:12
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yitiandeng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-08 18:16:12:
楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体 ...

好的
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6楼2012-04-08 20:18:18
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yitiandeng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-08 18:16:12:
楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体 ...

你没有应助我不能给你金币啊
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7楼2012-04-08 20:20:21
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1527017653

金虫 (正式写手)
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
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下雨天没有伞的孩子。。。。。。
8楼2012-04-08 21:01:32
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eileen8519

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by scienzyme at 2012-04-08 19:52:20:
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。

谢谢你的文献
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9楼2012-04-09 11:37:18
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by scienzyme at 2012-04-08 19:52:20:
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。

谢谢分享这些文献，最近也在看这方面的资料，太好了/
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你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2012-04-11 11:04:07
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