应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆
141/2返回列表12下一页
查看: 2089  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yitiandeng

木虫 (著名写手)

[求助] 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆

无连接酶亚克隆法，请亲们看好说明啊，别解释原理什么的

[ Last edited by yitiandeng on 2012-4-8 at 15:52 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-08 15:50:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yitiandeng: 金币+30, 18 2012-04-08 20:19:37
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。
赞一下(2人) 回复此楼

» 本帖附件资源列表
5楼2012-04-08 19:52:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忧郁的骑士

银虫 (初入文坛)
英语叫restriction free clone，RF clone，PCR产物两端有酶切载体的同源系列，15bp左右，PCR产物和酶切载体同时转化感受态大肠杆菌，大肠杆菌进行同源重组修复，形成环状。我们实验室用这种方法克隆了一万多个质粒，建库。
赞一下(2人) 回复此楼
12楼2012-10-13 18:06:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
.........................
不明白你的意图是什么，具体应用方向就有具体的方法，你说清楚了才好解释啊
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
2楼2012-04-08 15:56:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！欢迎发表更多的见解！ 2012-04-08 17:13:26
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR 产物        3ul
25度反应半小时后，转化大肠杆菌。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2012-04-08 17:10:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-08 17:10:22:
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR ...

楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体系，你总共加起来只有5uL，反应半个小时，是会极大降低重组效率的，说明书一般推荐5min左右，随片段长度而改变，我们就是用3Kb的去连接也只用15min左右，所以朋友，要严谨
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2012-04-08 18:16:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yitiandeng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-08 18:16:12:
楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体 ...

好的
回复此楼
6楼2012-04-08 20:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yitiandeng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-08 18:16:12:
楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体 ...

你没有应助我不能给你金币啊
赞一下 回复此楼
7楼2012-04-08 20:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1527017653

金虫 (正式写手)
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
赞一下 回复此楼
下雨天没有伞的孩子。。。。。。
8楼2012-04-08 21:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eileen8519

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by scienzyme at 2012-04-08 19:52:20:
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。

谢谢你的文献
回复此楼
9楼2012-04-09 11:37:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by scienzyme at 2012-04-08 19:52:20:
提供三篇相关文献，希望对楼主有帮助。

谢谢分享这些文献，最近也在看这方面的资料，太好了/
赞一下 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2012-04-11 11:04:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yitiandeng 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +5 小李0854 2026-03-16 5/250 2026-03-18 13:25 by allen-yin
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +6 Liwangman 2026-03-15 6/300 2026-03-18 13:21 by 尽舜尧1
[教师之家] 焦虑 +8 水冰月月野兔 2026-03-13 11/550 2026-03-18 13:10 by 水冰月月野兔
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +6 ZY-05 2026-03-13 7/350 2026-03-18 12:57 by allen-yin
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 0854，计算机类招收调剂 +3 胡辣汤放糖 2026-03-15 6/300 2026-03-18 12:09 by 上岸上岸……..
[考博] 环境领域全国重点实验室招收博士1-2名 +3 QGZDSYS 2026-03-13 5/250 2026-03-18 11:13 by QGZDSYS
[考研] 307求调剂 +3 冷笙123 2026-03-17 3/150 2026-03-18 09:55 by macy2011
[考研] 311求调剂 +10 冬十三 2026-03-15 11/550 2026-03-18 09:04 by zhukairuo
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林，给自己招师弟中～ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +4 梨花珞晚风 2026-03-17 4/200 2026-03-17 13:38 by houyaoxu
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +6 zlingli 2026-03-13 6/300 2026-03-15 20:00 by ryzcf
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 255求调剂 +3 李嘉慧， 2026-03-12 4/200 2026-03-14 16:58 by 有只狸奴
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 314求调剂 +7 无懈可击的巨人 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:40 by JourneyLucky
[考研] 277求调剂 +4 anchor17 2026-03-12 4/200 2026-03-13 11:15 by 白夜悠长
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭