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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆
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yitiandeng

木虫 (著名写手)

[求助] 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆

无连接酶亚克隆法，请亲们看好说明啊，别解释原理什么的

[ Last edited by yitiandeng on 2012-4-8 at 15:52 ]
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1楼 2012-04-08 15:50:10
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忧郁的骑士

银虫 (初入文坛)
英语叫restriction free clone，RF clone，PCR产物两端有酶切载体的同源系列，15bp左右，PCR产物和酶切载体同时转化感受态大肠杆菌，大肠杆菌进行同源重组修复，形成环状。我们实验室用这种方法克隆了一万多个质粒，建库。
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12楼2012-10-13 18:06:49
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
.........................
不明白你的意图是什么，具体应用方向就有具体的方法，你说清楚了才好解释啊
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-08 15:56:30
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！欢迎发表更多的见解！ 2012-04-08 17:13:26
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR 产物        3ul
25度反应半小时后，转化大肠杆菌。
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hehe
3楼2012-04-08 17:10:22
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-08 17:10:22:
你是不是说的是Invitrogen公司的Gateway技术？
1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物组合克隆目的片段，纯化回收
2.Invitrogen公司pENTR载体试剂盒
pENTR                 1UL
Salt solution         1ul
PCR ...

楼主问的是亚克隆技术哦，不是我挑刺，严格的说，入门克隆并不算亚克隆技术，而是克隆技术，之后的LR反应转入不同的载体才算是亚克隆技术，况且如果你以下的反应体系是搬自说明书的话，也是错的，说明书推荐6uL体系，你总共加起来只有5uL，反应半个小时，是会极大降低重组效率的，说明书一般推荐5min左右，随片段长度而改变，我们就是用3Kb的去连接也只用15min左右，所以朋友，要严谨
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Let God do with it as He wills
4楼2012-04-08 18:16:12
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