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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达の不可思议的重组
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 原核表达の不可思议的重组

各位师兄师姐请帮我分析下：我做一个原核表达目的基因连在T载体上进过英俊公司测序成功，能找到目的片段，接着双酶切连接，酶切为双酶切时间4h，连接16℃过夜，跳单克隆，进过菌落pcr有目的片段的送检，但是检测结果出其意料，尽然为意外一个载体的T载体连接序列。
解释：我做了两个不同载体的原核表达，目的序列一样，只是设计的引物前面酶切和保护碱基不同，在这次重组测序结果出来时我很奇怪的发现，A载体重组的序列尽然为B载体与T载体的序列，这是什么原因？之前A.B载体连在T载体上测序结果都是对的。载体提取的质粒以及酶切都很正常。
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1楼 2012-04-07 07:52:25
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xiaogang0301

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你的表述有点乱  是不是你的菌相互污染了 重新做 每一步做好检测验证
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做自己想做的
8楼2012-04-13 10:45:23
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
表述不是很清楚，可能是你在工作中某个环节弄错了，貌似不是重组的事
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weizhe34
3楼2012-04-07 11:18:06
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by panda73 at 2012-04-07 11:18:06:
表述不是很清楚，可能是你在工作中某个环节弄错了，貌似不是重组的事

就是说，表达了两个载体，他们的区别只是酶切和保护碱基不同，在连到T载体上时测序是正确的，后来经过双酶切和连接，对菌落pcr有目的条带的进行测序，发现其中一个重组的测序结果为另外一个片段与T载体连接的序列，不是重组的目的序列！！！
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4楼2012-04-07 12:26:17
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还是不太明白楼主的意思，最合理的解释就是中间某个环节污染了。其实做分子实验没有必要这么细究错在哪里，从头重做一次就行了，提高效率。
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生活是面镜子~
5楼2012-04-07 13:24:30
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