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805085868

铁虫 (小有名气)

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[交流] 求基因敲除高手。。。。

我基因敲除用的方法是同源重组，设计的上游同源臂测序之后发现有个别位点突变，请问影响基因敲除实验吗？会不会影响上游基因的表达？（上游基因的ORF与下游基因的ORF方向相同。）

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1楼 2012-03-31 21:25:40

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lincy2010

银虫 (小有名气)

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805085868(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+3, 回复很耐心啊~愚人节快乐O(∩_∩)O 2012-04-01 17:43:00

首先想问你测序的方式是什么？PCR产物直接测还是连到载体上再测？测的是双向还是单向？因为这些会影响测序结果的可信度。
其次，“个别位点突变”指的是只突变一个吗？如果同源臂较长，估计是不影响重组实验，但突变的位点会不会在重组体中那就不一定了，有机率在，也有机率不在。可以PCR包含上游同源臂的片断测序验证。
再次，如果筛选到的都有这个突变位点，会不会影响基因表达，要看突变的处于哪个位置。若在翻译区，会不会造成移码突变，若只是换了碱基，看蛋白序列改变了没；若在非翻译区，还在看是否改了启动子RBS等等，大概就是这样吧，说的不对的，请大家指正哈~
愚人节快乐，不得不说小木虫太有才啦^-^