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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求基因敲除高手。。。。
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805085868

铁虫 (小有名气)

[交流] 求基因敲除高手。。。。

我基因敲除用的方法是同源重组，设计的上游同源臂测序之后发现有个别位点突变，请问影响基因敲除实验吗？会不会影响上游基因的表达？（上游基因的ORF与下游基因的ORF方向相同。）
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1楼 2012-03-31 21:25:40
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lincy2010

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
805085868(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+3, 回复很耐心啊~愚人节快乐O(∩_∩)O 2012-04-01 17:43:00
首先想问你测序的方式是什么？PCR产物直接测还是连到载体上再测？测的是双向还是单向？因为这些会影响测序结果的可信度。
其次，“个别位点突变”指的是只突变一个吗？如果同源臂较长，估计是不影响重组实验，但突变的位点会不会在重组体中那就不一定了，有机率在，也有机率不在。可以PCR包含上游同源臂的片断测序验证。
再次，如果筛选到的都有这个突变位点，会不会影响基因表达，要看突变的处于哪个位置。若在翻译区，会不会造成移码突变，若只是换了碱基，看蛋白序列改变了没；若在非翻译区，还在看是否改了启动子RBS等等，大概就是这样吧，说的不对的，请大家指正哈~
愚人节快乐，不得不说小木虫太有才啦^-^
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3楼2012-04-01 01:40:52
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weishengsu5

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
突变不在CDS区域就不会有影响吧，除非位于终止序列。。
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5楼2012-04-01 21:54:52
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lwtong8320

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做基因敲除最好还是不要有碱基错误。如果突变体与野生型相比有变化，有时不好判断是不是这个错误碱基在里面起作用。
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6楼2012-04-02 12:29:38
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sisy_shaw

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇见了同样的问题，上下游同源臂都有好几个碱基的错配，不是到lz大人是怎么办的呢？求助~~~
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7楼2012-08-13 15:45:51
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FQQ12002A

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，我想咨询你一下，我想进行丝状真菌的敲除，但是载体没有，而且最初用来连目的基因的也没有，比如pSKH载体，怎么办呢？
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8楼2013-11-06 21:36:18
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是用什么同源重组的方法？自杀质粒？λ-red重组系统？同源臂多长？在什么位置的突变？这些问题没有的话。就不能分析了啊。同源臂有几个碱基的突变还可能是测序误差的。
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9楼2013-11-07 10:18:56
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__小朋友_2楼
2012-03-31 22:48   回复  
805085868(金币+1): 谢谢参与
Rosy_yidun4楼
2012-04-01 10:16   回复  
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币-10, 违规存档, 广告 2012-04-01 17:43:19
西瓜: 编辑内容 2012-04-01 17:43
-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 17:43 ]
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