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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教基因敲除问题

最近准备利用同源重组做链霉菌的基因阻断，有两个问题向有经验的高手请教：

1）在利用PCR-targeting做基因阻断时，用一个抗性基因置换要敲除的目的片段，置换进去的这个抗性基因在链霉菌中会不会对链霉菌本身其他基因的表达有影响？

2）在构建敲除的质粒时，通过PCR得到左右两个同源臂，利用引物设计时两端酶切位点连接在一起，这样在同源重组时会把两个同源臂之间的酶切位点给引入链霉菌中，这个引入的酶切位点会不会对链霉菌本身其他基因的表达有影响？在In frame deletion 阻断时，左右同源臂基因多长时重组效率比较高呢？

[ Last edited by srlee on 2010-12-19 at 10:48 ]
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1楼 2010-12-19 10:43:44
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
srlee(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2):good 2010-12-19 13:34:55
1，看你阻断的是什么基因了，如果阻断了一个必需的代谢途径导致代谢流不通，被阻断的代谢流之后的基因肯定会被影响。
2，如果不存在1中的问题，2中的问题就是杞人忧天了。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-12-19 12:38:47
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-19 12:38:47:
1，看你阻断的是什么基因了，如果阻断了一个必需的代谢途径导致代谢流不通，被阻断的代谢流之后的基因肯定会被影响。
2，如果不存在1中的问题，2中的问题就是杞人忧天了。

在链霉菌中大部分次生代谢基因是成簇排列的，只阻断某个代谢途径中的一个基因，那么这个代谢途径受到影响或者说这个代谢途径所要表达化合物就有可能不在产生了，这个是一定的！我想知道的是，经过同源重组从外源添加一段基因（如抗性基因）到链霉菌基因组上后，会不会对其他的成簇次生代谢基因表达产生影响或者产生表达压力呢？

[ Last edited by srlee on 2010-12-19 at 13:58 ]
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3楼2010-12-19 13:56:14
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by srlee at 2010-12-19 13:56:14:


在链霉菌中大部分次生代谢基因是成簇排列的，只阻断某个代谢途径中的一个基因，那么这个代谢途径受到影响或者说这个代谢途径所要表达化合物就有可能不在产生了，这个是一定的！我想知道的是，经过同源重组从外 ...

应该不会的。
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4楼2010-12-19 18:02:55
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
srlee(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~~ 2010-12-20 00:11:19
1：个人认为一般情况下不会受什么影响了，但是如果是好几个基因属于同一个操纵子，不排除polar effect的可能性！

2：不会影响！
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5楼2010-12-19 20:08:15
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~~ 2010-12-20 00:11:25
其实我也觉得没有影响，有许多文献也都是这么做的！在工作汇报时老板对此产生了一定的怀疑，但我也没有足够的证据来说服或证明给他看就一定没有影响，所以在此想向高手请教，希望能有一定的理由根据或证据来表明到底会不会有影响？
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6楼2010-12-19 21:53:13
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
srlee(金币+1):谢谢参与
1、通常是没有影响的，况且后面你不做抗性基因的去除吗？
2、什么叫“构建敲除质粒”？敲除会涉及到质粒构建吗？那个应该是FRT位点吧，最后，文献报道同源臂在40~60bp，选在50bp左右就可以了，效果很好
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7楼2010-12-20 09:36:30
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