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PCR标准体系有关问题。。求高手解答
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标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 其中10×扩增缓冲液是什么意思啊 前面怎么乘以10了， 4种dNTP混合物 各 200umol/L 这个200umol/L 不是浓度单位嘛？ 怎么配标准体系最后没有需要多少体积的该混合物 且引物的量不是定的吗？pmol是怎么换算成体积单位的啊？ Taq DNA聚合酶 2.5u 这个单位求解释的啊？ 不懂的唉 Mg2+ 1.5mmol/L 这个用量也不懂的。。。 问下大家配体系的时候是不是都换成体积单位进行试剂配置的 我自己做的PCR,体系所加试剂单位都是体积 刚看到这个标准体系 不懂的唉 求高手解答 问的低级问题 请勿喷哦。。。 谢谢 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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5楼2012-08-22 15:01:52
bbwalkman
木虫 (小有名气)
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1.10×的Buffer是酶的反应缓冲，是以十倍量保存，反应时要变成1×，所以100ul 体系里加了 10ul 2.dNTP一般是2.5mM的包装，你买的什么的都会有说明，所以根据你加的浓度换算成体积 3.引物是自己合成的链，这个根据你的体系加，还有你当初溶链时的浓度，然后根据你加的浓度换算体积，这个一般是过量的 4.酶量的确定可根据你聚合酶的说明书来定，U指的是Unit，就是每ul里有多少单位，根据你酶的活性加入相应的体积 5.Mg2+一般不用单独加，反应Buffer里面有，但是可能这个反应体系需要自己加吧 6.关于体积问题都要根据你储备液的浓度以及相应你要用的终浓度来换算的 |
2楼2012-03-27 10:26:13
atlanticwi
金虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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嗯......木有人喷你了，大家都是这个阶段过来的啦 1. 10X的意思是10倍浓缩储存液，工作液是一般是1X的，所以你总体系如果用100uL，就会用10uL的缓冲液，最后不是稀释了10倍嘛~ 2. 4种dNTP混合物，是浓度标定的呀，我们一般PCR使用2.5uM（也就是2.5umol/L，但我这里指的是混好的，不是你这种分开放的)，用2~3uL就够了（针对20uL体系）所以你可以计算一下，以放大或缩小你需要加的量 3. 引物的量当然是定的了，你订来的引物需要加水溶解至储存液（我们用100uM），然后稀释至工作液（我们一般PCR用10uM），20uL的体系加1uL就够了，你可以算一下是不是在这个引物给定范围内。 4. 酶都是按活力单位U给的，不过也有给你每uL多少U的，你换算成体积（uL）就成了哦 5. Mg离子一般缓冲液会含有的，但是某些公司就是分开装的，所以遇到这种情况，你把它按你总体系多少换算过来需要多少uL Mg离子量 6. 所以配PCR体系都是按照体积加的哦~~~~~~ 如有写错，希望高手指正，祝实验顺利  |
3楼2012-03-27 10:26:41
4楼2012-03-31 19:50:03
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