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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 救命啊！荧光定量PCR 扩增问题
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2010203011

银虫 (小有名气)

[求助] 救命啊！荧光定量PCR 扩增问题

质粒扩增和样品扩增曲线不一样。
1，湖水总细菌DNA提取，Omega biotek的水体DNA提取试剂盒
2，引物为文献中的经典引物，退火温度在梯度PCR仪上找的较为适合的温度。
3，荧光定量PCR仪为ROTOR Gene-6000，试剂盒为QIAGEN。
4，质粒是用样品DNA的PCR产物，回收后重组后提取，按10倍稀释成标准品。
结果，每次做的试验结果，样品的扩增曲线总是很奇怪，不光滑。和质粒就很不一样。我已经排除了以下几个原因：
1. 扩增体系，QIAGEN 和Takara的试剂盒都试过，一样的 问题
2.仪器问题，用过ABI7500比较过，一样的 问题。
3. 引物，都是文献中比较常用的引物，noszF/1622-R等。
4.模板，借用了别人用mobio提取的土壤DNA，也有问题，是不是可以排除不是试剂盒的问题？
5.耗材，ABI和Axygen的用，也没有解决问题。

求救，博士二年级了，文章还在等数据，急死人了，不知道有没有碰到这样情况的，请教啊~
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1楼 2012-03-13 16:16:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yz_fish

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2010203011: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-22 09:46:53
把湖水提取出来的模板DNA稀释十倍，一百倍或者一千倍后试试，保证楼主能得到心仪的扩增曲线
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2010203011
5楼2012-03-14 10:03:03
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普通回帖

2010203011

银虫 (小有名气)
2楼2012-03-13 20:42:34
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我叫路人甲

银虫 (小有名气)
额，，帮顶一下吧。。。
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3楼2012-03-14 00:22:27
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Lxr8388

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2010203011: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-22 09:47:21
换一种菌的DNA为模板试一下，有可能是从土壤中提取基因组含有杂质影响qPCR的体系吧。排除样本质量的影响
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2010203011
4楼2012-03-14 09:10:49
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曼陀罗198888

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2010203011: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-04-22 09:47:31
扩增曲线不好应该是样本的问题，纯度和浓度要注意下
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2010203011
6楼2012-03-14 10:52:12
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2010203011

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
楼: Originally posted by Lxr8388 at 2012-03-14 09:10:49:
换一种菌的DNA为模板试一下，有可能是从土壤中提取基因组含有杂质影响qPCR的体系吧。排除样本质量的影响

这个模板原因，也是我目前很想解决的问题，不知道用qiagen的DNA回收纯化试剂盒能不能解决~样本质量的影响，要怎么解决咯~？
另外，不知道怎么给金币，呵呵，没经验~
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7楼2012-03-14 16:53:39
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2010203011

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by yz_fish at 2012-03-14 10:03:03:
把湖水提取出来的模板DNA稀释十倍，一百倍或者一千倍后试试，保证楼主能得到心仪的扩增曲线

呵呵，谢谢~我觉得我的DNA浓度不算高啊，不过不管怎样，我先试试看。
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8楼2012-03-14 16:55:19
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2010203011

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by 曼陀罗198888 at 2012-03-14 10:52:12:
扩增曲线不好应该是样本的问题，纯度和浓度要注意下

谢谢~
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9楼2012-03-14 16:55:40
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2010203011

银虫 (小有名气)
10楼2012-03-15 15:35:26
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