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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切（Kpn1/BamH1）T-Simple载体，没有得到目的条带……
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冰凝东

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切（Kpn1/BamH1）T-Simple载体，没有得到目的条带……

将目的基因连接到了pMD18-T-Simple载体上，挑单克隆提取了质粒，目的基因的酶切位点是Kpn1和BamH1，今日对所提质粒进行双酶切，所用酶是TaKaRa的，体系如下：10×K Buffer   1μ，
       质粒   15μ，
       Kpn1   1μ，
       BamH1    1μ，
       ddH2O   2μ
37℃双酶切过夜，凝胶检测没有目的条带……目的条带750bp。年前同样体系双酶切其他基因没有问题！！
小弟新人，金币不多，希望能得到建设性意见……
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1楼 2012-02-18 11:42:19
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冰凝东

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2012-02-18 15:01:46:
试着分析了几个原因，仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了？
2、不知道在这个载体中，两个酶切位点离得远不远，如果较近的话可能切不开，可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低，就是酶有没 ...

1、以质粒为模板PCR结果显示含有目的条带！
2、目的基因750bp，酶切位点当然在两端，距离问题不是问题吧？pMD18-T-simple载体不知道你有没有用过……哎！
3、已证实没问题！
很感谢你的帮助啊！我重新挑单克隆提质粒了，双酶切成功！
祝好！
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3楼2012-02-19 16:39:20
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2012-02-18 19:32:11
冰凝东(金币+1): ★有帮助 2012-02-19 16:42:39
试着分析了几个原因，仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了？
2、不知道在这个载体中，两个酶切位点离得远不远，如果较近的话可能切不开，可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低，就是酶有没有失活，可做一次对照。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-02-18 15:01:46
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