24小时热门版块排行榜    

查看: 1964  |  回复: 2
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

冰凝东

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切(Kpn1/BamH1)T-Simple载体,没有得到目的条带……

将目的基因连接到了pMD18-T-Simple载体上,挑单克隆提取了质粒,目的基因的酶切位点是Kpn1和BamH1,今日对所提质粒进行双酶切,所用酶是TaKaRa的,体系如下:10×K Buffer   1μ,
       质粒   15μ,
       Kpn1   1μ,
       BamH1    1μ,
       ddH2O   2μ
37℃双酶切过夜,凝胶检测没有目的条带……目的条带750bp。年前同样体系双酶切其他基因没有问题!!
小弟新人,金币不多,希望能得到建设性意见……
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰凝东

金虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by imyting at 2012-02-18 15:01:46:
试着分析了几个原因,仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了?
2、不知道在这个载体中,两个酶切位点离得远不远,如果较近的话可能切不开,可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低,就是酶有没 ...

1、以质粒为模板PCR结果显示含有目的条带!
2、目的基因750bp,酶切位点当然在两端,距离问题不是问题吧?pMD18-T-simple载体不知道你有没有用过……哎!
3、已证实没问题!
很感谢你的帮助啊!我重新挑单克隆提质粒了,双酶切成功!
祝好!
3楼2012-02-19 16:39:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 3 个回答

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助! 2012-02-18 19:32:11
冰凝东(金币+1): 有帮助 2012-02-19 16:42:39
试着分析了几个原因,仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了?
2、不知道在这个载体中,两个酶切位点离得远不远,如果较近的话可能切不开,可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低,就是酶有没有失活,可做一次对照。
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2012-02-18 15:01:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 北京林业大学硕导招生广告 +3 kongweilin 2026-03-26 3/150 2026-03-26 00:53 by 15723253818
[考研] 调剂310 +3 温柔的晚安 2026-03-25 4/200 2026-03-25 23:16 by peike
[考研] 网络空间安全0839招调剂 +4 w320357296 2026-03-25 6/300 2026-03-25 17:59 by 255671
[考研] 0854人工智能方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-24 4/200 2026-03-25 13:29 by 2177681040
[考研] 一志愿吉林大学材料与化工303分求调剂 +4 为学666 2026-03-24 4/200 2026-03-25 11:27 by BruceLiu320
[考研] 271求调剂 +4 生如夏花… 2026-03-22 4/200 2026-03-25 11:25 by userper
[考研] 086003食品工程求调剂 +6 淼淼111 2026-03-24 6/300 2026-03-25 10:29 by 3Strings
[考研] 07化学280分求调剂 +7 722865 2026-03-23 7/350 2026-03-25 09:29 by aa331100
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[有机交流] 有机合成求助 20+3 FENGSHUJEI 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:31 by 88817753
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 一志愿吉大化学322求调剂 +4 17501029541 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:21 by 戴围脖的小蚊子
[考研] 一志愿武理材料工程348求调剂 +6  ̄^ ̄゜汗 2026-03-19 9/450 2026-03-23 19:53 by pswait
[考研] 一志愿东华大学化学070300,求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 一志愿东华大学控制学硕320求调剂 +3 Grand777 2026-03-21 3/150 2026-03-21 19:23 by 简之-
[考研] 材料与化工(0856)304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-20 7/350 2026-03-21 19:05 by 15709483992
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 @taotao 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:35 by JourneyLucky
信息提示
请填处理意见