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冰凝东

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切(Kpn1/BamH1)T-Simple载体,没有得到目的条带……

将目的基因连接到了pMD18-T-Simple载体上,挑单克隆提取了质粒,目的基因的酶切位点是Kpn1和BamH1,今日对所提质粒进行双酶切,所用酶是TaKaRa的,体系如下:10×K Buffer   1μ,
       质粒   15μ,
       Kpn1   1μ,
       BamH1    1μ,
       ddH2O   2μ
37℃双酶切过夜,凝胶检测没有目的条带……目的条带750bp。年前同样体系双酶切其他基因没有问题!!
小弟新人,金币不多,希望能得到建设性意见……
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励积极应助! 2012-02-18 19:32:11
冰凝东(金币+1): ★有帮助 2012-02-19 16:42:39
试着分析了几个原因,仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了?
2、不知道在这个载体中,两个酶切位点离得远不远,如果较近的话可能切不开,可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低,就是酶有没有失活,可做一次对照。
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2012-02-18 15:01:46
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冰凝东

金虫 (小有名气)

引用回帖:
楼: Originally posted by imyting at 2012-02-18 15:01:46:
试着分析了几个原因,仅供参考
1、你确定你的目的基因已经在质粒载体上了?
2、不知道在这个载体中,两个酶切位点离得远不远,如果较近的话可能切不开,可以试试分别单酶切。
3、这个可能性比较低,就是酶有没 ...

1、以质粒为模板PCR结果显示含有目的条带!
2、目的基因750bp,酶切位点当然在两端,距离问题不是问题吧?pMD18-T-simple载体不知道你有没有用过……哎!
3、已证实没问题!
很感谢你的帮助啊!我重新挑单克隆提质粒了,双酶切成功!
祝好!
3楼2012-02-19 16:39:20
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