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shenxing325

铜虫 (小有名气)

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[求助] 求助，Western-Blot转膜不成功

各位虫友，做了两次Western-Blot转膜都不成功，想各位帮我指点一下可能的原因，这些是我做实验的时候的条件细节：
      目的蛋白大小100kD左右，用的是湿转法，电转缓冲液（5×）的配方是：
      Glycine 15.1g
      Tris       72g
      SDS       5g
      定容至一升，使用前取200mL，再加700mL水和100mL甲醇，4度备用
      滤纸（3mm滤纸用两边各用两层）比膜和胶大比较多，之前看过一些人说滤纸要比膜小，但是好像大多数人都说对于湿转来说没有关系。
      膜用的是0.45um的PVDF膜，这个有人说要用0.22um的，是这样吗？
      电转于4度冰柜中进行，80V电压，时间2h，用立春红染色，但是什么都没有，我没有用预染Marker。
   看大多数人都说湿转是非常容易成功的，我的实验操作哪里有问题吗？请指教，谢谢！

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1楼2012-01-12 17:51:39

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qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励交流！ 2012-01-15 16:07:54
amisking: 金币+10, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-10-17 20:45:31

有些经验性的东西看看对你能否有用处
1. SDS-PAGE，首先看你的电泳有没有跑好，将两块胶同样上样电泳，最好是在一个电泳槽里面电泳。伯乐的mini槽蛮好的，又快功能又多，我们一直用。一块用于考马斯亮蓝染色，另一块用于转膜，切记。一定要能在你的对照胶上找到你的蛋白质。
2. 切胶做三明治。PVDF膜在纯甲醇中活化30s（用镊子按到甲醇里），取出放入转移缓存液中备用。切胶尽量大小合适一点，别拿整块胶上去搞，膜与胶大小一致，滤纸小一点即可，千万不能大了，大了绝对是会短路的（因为你是要把它压紧的，湿滤纸接触后电阻小，直接绕过胶了）。整个切胶过程要湿润，切好了胶立即放入转移缓存液中，所有过程戴手套进行，镊子夹取时不能夹到中间。
三明治顺序：负极－滤纸（2－3层）－胶－PVDF膜－滤纸－正极，每一层都要赶走气泡，气泡很容易发现，用玻璃棒擀，一定不要用枪头戳（很容易戳坏滤纸，尤其是胶）
夹紧过程要果断迅速，不然会错位。
3. 转膜。首先，转膜缓冲液要充足，配方要准确，其中涉及到SDS和甲醇的比例，这两者是消长关系。一般认为，如果是小分子量的蛋白比如十几KD，甲醇比例要高（我加了30%的甲醇就彻底没有加SDS），大分子量的则SDS要高，甲醇要低（这是某公司技术总监说的经验）。
其次，是转膜的缓冲液要冷，大家都知道要预冷，可是整个过程产热很严重的，条件差一点的也要放4度冰箱，一般用“冰水浴”（冰水浴传热效果好），伯乐的mini槽都配有冰盒，建议拆掉一包生物冰袋，把胶状物倒到冰盒里面冻成冰，尤其要注意不能倒太多，容易把冰盒撑变形，最多70%即可（一般冰块很容易就化光了，生物冰袋持久一些）。
最后，转膜条件。一定要找到最佳的转膜条件，这个能借鉴的很多，根据实际情况自己摸索一下，电压和时间，注意要转完全啊，最好是能带着预染Marker一起，这就方便多了。有个流程上说小于120KD的蛋白250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours，参考一下。
4. 清洗平衡，将PVDF膜放入1X TBST中浸泡5分钟。摇床摇动。这一步很重要，从含有甲醇的有机相中转入水相中的过渡。
5. 封闭，将膜面（载有蛋白的一面）朝上，放入封闭液中，4度过夜封闭。
至此，前半段基本完成，这时就已经很晚了，兄弟，可以回去睡觉了