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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 了解蛋白质性质及其熟悉电泳的高手请进！
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落满夏天

银虫 (正式写手)

[求助] 了解蛋白质性质及其熟悉电泳的高手请进！

小弟做一种蛋白的电泳时，遇到一个问题，在主条带的下面有两条杂带，但是同一样品做分子筛液相分析就没有，因此我判断是降解条带，该蛋白分子量大概是20000多点，等电点大概是１１。降解带分子量在一万五左右，有时候有两条，我们用的是变性ＳＤＳ－Page ，蛋白缓冲液是PH 为７.０的Pb 。不知道是什么原因降解，处理的时候是加处理液１００度水浴。不知道大家有没有解决蛋白电泳降解的经验，小弟感激不尽了。蛋白纯化时，离子交换和分子筛都是过的。
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星星之火，可以燎原
1楼2012-01-09 16:06:13
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2012-01-09 19:59:24
落满夏天(金币+1): 2012-01-11 16:33:24
可能蛋白质样品 是多聚体。靠二硫键结合，在SDS作用下会变性成单聚体。如抗体在SDS PAGE 中就有两条带。
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2楼2012-01-09 18:49:51
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
落满夏天(金币+2): 2012-01-11 16:33:12
分子筛液相的灵敏度没有电泳高，你要是做反相，也许比电泳纯度还低。
蛋白破坏应该是样品缓冲液中的巯基物和sds，我觉得你是纯化的问题，应该是样品不纯。
你可以去除样品缓冲液和电泳缓冲液中的巯基物和sds，跑个电泳看看。
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3楼2012-01-10 12:49:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

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1.会不会是Marker 在上完样 加缓冲液的时候 溢到相邻的样品槽里
2.沸水加热处理样品没有什么错误，你是怎么确定他会出现降解的可能啊
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4楼2012-01-10 16:36:19
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qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我只知道SDS-PAGE是变性电泳，跑出来的都是亚基，同一样品做分子筛液相分析应该不是变性的吧，建议做活性电泳，可能就是一个蛋白了
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毕业回望科研路，满目疮痍一身土
5楼2012-01-11 10:09:38
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xiaohaizi0220

木虫 (正式写手)

基础研发之沉默

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先做一个非变性胶跑一下电泳看看。
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有限的我却思考无限的存在
6楼2012-01-11 11:13:32
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落满夏天

银虫 (正式写手)
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楼: Originally posted by kaobo2012 at 2012-01-09 18:49:51:
可能蛋白质样品 是多聚体。靠二硫键结合，在SDS作用下会变性成单聚体。如抗体在SDS PAGE 中就有两条带。

这个蛋白结构已经知道不存在二硫键，紫外扫描也超零点几个纳米，活性也一直不好。
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星星之火，可以燎原
7楼2012-01-11 16:27:55
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落满夏天

银虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-01-10 12:49:12:
分子筛液相的灵敏度没有电泳高，你要是做反相，也许比电泳纯度还低。
蛋白破坏应该是样品缓冲液中的巯基物和sds，我觉得你是纯化的问题，应该是样品不纯。
你可以去除样品缓冲液和电泳缓冲液中的巯基物和sds，跑 ...

样品缓冲液已经是最后的原液，应该没有巯基物了，sds我在考虑，是不是破坏了蛋白结构，原液里没有，电泳缓冲液和处理液是有的。另外该蛋白没有二硫键，活性一直不好，也还在找问题。先谢谢了。
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星星之火，可以燎原
8楼2012-01-11 16:32:58
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落满夏天

银虫 (正式写手)
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楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-01-10 16:36:19:
1.会不会是Marker 在上完样 加缓冲液的时候 溢到相邻的样品槽里
2.沸水加热处理样品没有什么错误，你是怎么确定他会出现降解的可能啊

一的可能性没有，降解的话我是通过液相分子筛确定的，因为电泳上条带分的很远，在分子筛上这种情况一定可以分开，另外我关注电泳已经有一段时间了。应该是降解无疑，只是不知道原因何在，也许是因为有的键键能太低。还在研究中。
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星星之火，可以燎原
9楼2012-01-11 16:36:55
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落满夏天

银虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by qiyaocheng at 2012-01-11 10:09:38:
我只知道SDS-PAGE是变性电泳，跑出来的都是亚基，同一样品做分子筛液相分析应该不是变性的吧，建议做活性电泳，可能就是一个蛋白了

我在考虑是不是因为sds的关系，因为其他条件不变，不水浴加热的话也是有降解调带的，做活性电泳的话是不是去掉电极液和处理液中的sds。该蛋白紫外扫描超零点几个纳米，活性也一直不好，不知道是不是不稳定的关系。如果您对蛋白活性有研究请指教.
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星星之火，可以燎原
10楼2012-01-11 16:44:14
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